砷劑對皮膚角質(zhì)形成細胞P53功能的影響及其機制研究.pdf

1、流行病學(xué)研究表明低濃度砷劑的暴露與皮膚癌等各種腫瘤的發(fā)生有關(guān)。砷劑雖然被公認為是人類的致癌劑之一，但是其致癌作用機制仍存在爭論。有的學(xué)者認為砷劑可單獨引起腫瘤的發(fā)生，而有的學(xué)者認為砷劑只是協(xié)同其它致癌物導(dǎo)致正常細胞的惡性轉(zhuǎn)化。p53基因是己知的抑癌基因之一，其介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑在細胞的增殖分化、應(yīng)激和癌變等生命過程中起著極其重要的作用，被稱為“基因組衛(wèi)士”。鼠雙微粒體2(murine double minute2，MDM2)基因是p53

2、的下游基因之一，p53可激活MDM2轉(zhuǎn)錄，MDM2反過來又抑制p53的功能，二者形成自動調(diào)節(jié)反饋環(huán)，以保持正常情況下p53處于低水平狀態(tài)。正確的亞細胞定位對于p53的功能活性十分重要，p53被激活后進入胞核內(nèi)，激活其靶基因的轉(zhuǎn)錄，之后回到胞漿中被降解。MDM2由于具有核輸出序列(NES)和核定位序列(NLS)而具有核漿穿梭能力，NES使MDM2由胞核到胞漿而NLS使之由胞漿到胞核。MDM2蛋白可把p53/MDM2復(fù)合物直接運出細胞核，M

3、DM2的核漿穿梭能力對其抑制p53的功能活性非常重要。本課題研究中，我們以hTERT永生化的皮膚角質(zhì)形成細胞為研究對象，探討了砷劑對皮膚角質(zhì)形成細胞p53功能的影響及MDM2在其中所起的作用機制，為闡明砷劑引起皮膚癌的機理提供新的實驗依據(jù)。 第一章低濃度砷劑經(jīng)由上調(diào)MDM2介導(dǎo)p53胞漿分布所致功能失活 目的：探討低濃度砷劑對人皮膚角質(zhì)形成細胞中MDM2蛋白的影響及其與p53的亞細胞分布狀態(tài)和功能的關(guān)系。 方法：

4、以hTERT永生化的皮膚角質(zhì)形成細胞為研究對象。采用蛋白印跡法(Western blotting)研究0.5μmol/L、1μmol/L，和2μmol/L亞砷酸鈉處理12小時和24小時后MDM2、p53和絲氨酸15位磷酸化的p53蛋白的表達水平，并且與5-Fu和紫外線處理作比較。采用細胞免疫熒光染色法研究砷劑處理前后p53蛋白的亞細胞定位及細霉素B和Nutlin-3預(yù)處理對其影響。 結(jié)果：低濃度砷劑上調(diào)了角質(zhì)形成細胞中MDM2蛋

5、白的表達，但對p53蛋白表達無明顯影響。隨著低濃度砷劑劑量的逐漸增加，MDM2蛋白的表達水平亦逐漸增加；隨著砷劑作用時間的逐漸增加，MDM2蛋白的表達水平也逐漸增強。低濃度砷劑處理后角質(zhì)形成細胞p53蛋白主要分布在胞漿。細霉素B和Nutlin-3預(yù)處理可以阻斷砷劑誘導(dǎo)的p53胞漿分布。先用低濃度砷劑處理角質(zhì)形成細胞后再加5-Fu刺激，此時5-Fu激活p53功能受到明顯的抑制。 結(jié)論：低濃度砷劑呈劑量和時間依賴性上調(diào)角質(zhì)形成細胞中

6、MDM2蛋白的表達；低濃度砷劑可經(jīng)由上調(diào)MDM2蛋白表達介導(dǎo)p53的胞漿分布；低濃度砷劑誘導(dǎo)的p53胞漿分布導(dǎo)致p53功能性失活。 第二章低濃度砷劑上調(diào)MDM2的機制探討 目的：探討低濃度砷劑上調(diào)MDM2表達的作用機制。 方法：構(gòu)建pGL3-MDM2基因啟動子報告基因表達載體，采用熒光素酶報告基因分析方法觀察亞砷酸鈉對MDM2基因P1、P2啟動子轉(zhuǎn)錄活性的影響。應(yīng)用1μmol/L和2μmol/L亞砷酸鈉處理皮膚角

7、質(zhì)形成細胞24h后采用逆轉(zhuǎn)錄.聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測MDM2 mRNA的表達水平。應(yīng)用PD98059、SB203580和LY294002等特異性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑預(yù)處理后再觀察砷劑對角質(zhì)形成細胞MDM2表達的影響。 結(jié)果：低濃度砷劑可顯著誘導(dǎo)MDM2基因P1啟動子的熒光素酶活性(P<0.05)。隨著低濃度砷劑的劑量逐漸增加，MDM2 mRNA的表達水平逐漸增高。PD98059預(yù)處理可完全阻斷砷劑上調(diào)角質(zhì)形成細胞中M

8、DM2的表達，而SB203580和LY294002預(yù)處理對砷劑誘導(dǎo)的MDM2表達上調(diào)無明顯影響。 結(jié)論：通過MAPK/ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，低濃度砷劑激活MDM2基因p1啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，從而誘導(dǎo)MDM2的表達。 第三章低濃度砷劑通過功能性失活p53發(fā)揮輔助致癌作用 目的：探討低濃度砷劑對紫外線引起角質(zhì)形成細胞凋亡的影響及其與砷性皮膚癌作用機制的關(guān)系。 方法：應(yīng)用0.5μmol/L和1μmol/L亞砷酸鈉處

9、理角質(zhì)形成細胞24h后，再用40mJ/cm2紫外線照射。采用流式細胞術(shù)和Hoechst33258胞核染色檢測砷劑和UV引起的細胞凋亡。 結(jié)果：0.5μmol/L和1μmol/L砷劑處理角質(zhì)形成細胞后凋亡率分別為1.2％和1.5％，與正常對照組1.5％無顯著性差異(P>0.05)。而先經(jīng)過0.5μmol/L和1μmol/L砷劑預(yù)處理后的角質(zhì)形成細胞再照射紫外線，此時凋亡率分別為48.8％和39.9％，與未經(jīng)砷劑預(yù)處理直接照射UV組