酵母雙雜交技術(shù)篩選與P53蛋白相互作用的新蛋白的研究.pdf

1、腫瘤抑制因子P53是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，是細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中主要的調(diào)控因子之一，在保持細(xì)胞基因組的完整性，抑制惡性腫瘤增殖中起到至關(guān)重要的作用。當(dāng)細(xì)胞遭受不同程度的損傷時(shí)，P53選擇性地轉(zhuǎn)錄激活編碼細(xì)胞周期蛋白或促凋亡蛋白的基因，使細(xì)胞停滯于G1期，允許細(xì)胞進(jìn)行自我修復(fù)，或啟動(dòng)細(xì)胞程序性死亡，使細(xì)胞自殺，從而阻止有癌變傾向的突變細(xì)胞的生成。
　　 基因組脅迫能對(duì)細(xì)胞或生物組織造成嚴(yán)重的損傷，甚至能導(dǎo)致機(jī)體死亡?；蚪M脅迫的一種主要的來(lái)源是

2、細(xì)胞DNA損傷。細(xì)胞內(nèi)存在一個(gè)精細(xì)的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)感知DNA損傷，調(diào)控細(xì)胞進(jìn)行周期靜止，細(xì)胞凋亡，細(xì)胞衰老等生物學(xué)反應(yīng)。而P53蛋白位于這個(gè)網(wǎng)絡(luò)的重要位置，它能通過(guò)被DNA損傷信號(hào)通路中的一系列激酶磷酸化而成為活化形式，轉(zhuǎn)錄下游靶基因，進(jìn)而掌控細(xì)胞的命運(yùn)。
　　 目前對(duì)P53蛋白功能的研究主要集中在P53對(duì)下游靶基因轉(zhuǎn)錄激活的選擇性的調(diào)控。以往的研究發(fā)現(xiàn)，存在一類P53結(jié)合蛋白，它們與P53蛋白的結(jié)合能影響P53轉(zhuǎn)錄靶基因的選擇性。為

3、了進(jìn)一步探討P53的功能，我們采用酵母雙雜交技術(shù)篩選與P53相互作用的新蛋白。我們利用去掉N端轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的P53作為誘餌蛋白篩選人骨髓cDNA文庫(kù)，最終得到99個(gè)陽(yáng)性克隆，并首次發(fā)現(xiàn)一個(gè)帶有鋅指結(jié)構(gòu)域和WD40結(jié)構(gòu)域的新P53結(jié)合蛋白，我們以克隆號(hào)將其命名為207。有研究顯示該蛋白同時(shí)位于由DNA損傷引起的ATM/ATR信號(hào)通路中，是ATM/ATR激酶的底物。我們?cè)诓溉閯?dòng)物細(xì)胞內(nèi)驗(yàn)證了P53與207的結(jié)合，并通過(guò)熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)

4、到207可以激活P53的轉(zhuǎn)錄活性。在用UV照射刺激的DNA損傷誘導(dǎo)下，我們發(fā)現(xiàn)207能穩(wěn)定P53蛋白水平，并一定程度提高P53下游靶蛋白BAX蛋白水平。我們還發(fā)現(xiàn)在U2OS細(xì)胞中，UV照射刺激的DNA損傷誘導(dǎo)207亞細(xì)胞定位的改變，由細(xì)胞核仁內(nèi)游離至整個(gè)細(xì)胞核中。
　　 我們的工作首次發(fā)現(xiàn)207蛋白與P53蛋白在細(xì)胞內(nèi)的結(jié)合，并初步探討了此種結(jié)合對(duì)P53的影響，發(fā)現(xiàn)了207蛋白在DNA損傷誘導(dǎo)P53功能調(diào)控中的潛在作用，為以后的