日本血吸蟲(chóng)感染不同適宜性嚙齒類(lèi)動(dòng)物后宿主及蟲(chóng)體miRNA表達(dá)分析.pdf

1、血吸蟲(chóng)病是由血吸蟲(chóng)感染引起的危害嚴(yán)重的人畜共患寄生蟲(chóng)病，在我國(guó)流行的是日本血吸蟲(chóng)病，目前仍是我國(guó)最重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。日本血吸蟲(chóng)可感染40多種哺乳動(dòng)物宿主，不同宿主對(duì)血吸蟲(chóng)感染的適宜性存在較大的差別。山羊、黃牛、綿羊、兔子和小鼠等都是其適宜宿主，血吸蟲(chóng)的發(fā)育率可達(dá)50％～70％，而在大鼠、水牛等非適宜宿主體內(nèi)血吸蟲(chóng)的發(fā)育率僅為10％左右，東方田鼠是至今發(fā)現(xiàn)的唯一一種感染血吸蟲(chóng)后不致病的哺乳動(dòng)物，血吸蟲(chóng)感染東方田鼠后，蟲(chóng)體發(fā)育遲緩，大

2、部分蟲(chóng)體在感染后15天死亡，不能發(fā)育成熟。不同的宿主有著獨(dú)特的機(jī)體內(nèi)環(huán)境，會(huì)影響日本血吸蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育、雌雄合抱和蟲(chóng)卵形成，最終影響蟲(chóng)體在宿主體內(nèi)的存活狀態(tài)及宿主的病理變化。
　　miRNA是一種內(nèi)源性的非編碼小RNA分子，研究發(fā)現(xiàn)其在多個(gè)生物學(xué)過(guò)程如生長(zhǎng)發(fā)育、凋亡、增殖、細(xì)胞分化、能量代謝、免疫調(diào)控及腫瘤發(fā)生等發(fā)揮重要的作用。本研究利用Solexa高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)不同適宜性嚙齒類(lèi)宿主來(lái)源的童蟲(chóng)進(jìn)行miRNA的鑒定及分析，對(duì)與mi

3、RNA調(diào)節(jié)息息相關(guān)的血吸蟲(chóng)凋亡通路及凋亡相關(guān)基因作了分析;利用miRNA芯片比較、分析小鼠、大鼠和東方田鼠三種不同適宜性宿主感染日本血吸蟲(chóng)前后miRNA的表達(dá)譜變化。本研究可加深理解miRNA在血吸蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育、與宿主相互作用等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮的調(diào)節(jié)作用提供理論基礎(chǔ)，也可為篩選血吸蟲(chóng)的早期診斷分子標(biāo)記、疫苗候選分子和新治療藥物靶標(biāo)提供新的思路和新途徑。
　　一、不同適宜性嚙齒類(lèi)宿主來(lái)源日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)miRNA的初步鑒定及血吸蟲(chóng)凋亡

4、研究
　　用Solexa深度測(cè)序法對(duì)小鼠、大鼠和東方田鼠來(lái)源的日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果一共得到35585878條高質(zhì)量的reads，其中有效的reads共有28088302條。進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析表明，小鼠來(lái)源的童蟲(chóng)中有131個(gè)miRNA，大鼠來(lái)源的童蟲(chóng)中有100個(gè)，東方田鼠來(lái)源童蟲(chóng)有144個(gè)，其中有32個(gè)miRNA在三種宿主來(lái)源童蟲(chóng)中均有表達(dá)，并對(duì)已知的28個(gè)日本血吸蟲(chóng)miRNA分子進(jìn)行聚類(lèi)和差異表達(dá)分析。本研究共鑒定出5

5、0個(gè)新miRNA分子，其中保守的有34條，日本血吸蟲(chóng)特有的有16條。這些miRNA分子的發(fā)現(xiàn)對(duì)研究日本血吸蟲(chóng)在不同宿主體內(nèi)的生長(zhǎng)發(fā)育、凋亡、營(yíng)養(yǎng)代謝及相互作用提供了有價(jià)值信息，為后續(xù)深入研究miRNA分子在血吸蟲(chóng)基因表達(dá)調(diào)控中的可能作用機(jī)制提供了理論依據(jù)。
　　本課題組前期研究表明凋亡是促使日本血吸蟲(chóng)在東方田鼠體內(nèi)消亡的主要原因之一，研究中對(duì)不同宿主來(lái)源童蟲(chóng)的miRNA進(jìn)行分析時(shí)也發(fā)現(xiàn)部分差異表達(dá)的miRNA可能與凋亡調(diào)控相關(guān)。本

6、研究使用凋亡常用的檢測(cè)方法TUNEL(terminal deoxynucleotidyltransferase-mediated dUTP nick-end labeling)和DAPI雙染法，定性分析日本血吸蟲(chóng)14天童蟲(chóng)蟲(chóng)體細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。應(yīng)用Annexin V-FITC/propidium iodide(PI)(AnnexinV/PI)技術(shù)定量分析14天和23天日本血吸蟲(chóng)蟲(chóng)體細(xì)胞的凋亡比例，采用商業(yè)化哺乳動(dòng)物凋亡關(guān)鍵分子Caspase

7、3和Caspase7活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)日本血吸蟲(chóng)蟲(chóng)體Caspase3和Caspase7的活性，結(jié)果顯示童蟲(chóng)期蟲(chóng)體的活性高于成蟲(chóng)，雄性成蟲(chóng)的活性高于雌性成蟲(chóng)，相應(yīng)的結(jié)果得到qPCR驗(yàn)證。研究發(fā)現(xiàn)，廣譜的凋亡抑制劑caspase peptide inhibitor(Z-VAD-FMK)對(duì)日本血吸蟲(chóng)蟲(chóng)體的Caspase3/7活性有著很好的抑制作用。通過(guò)對(duì)不同期別日本血吸蟲(chóng)凋亡相關(guān)基因的qPCR分析，進(jìn)一步明確了日本血吸蟲(chóng)可能存在的凋亡通路。這

8、些結(jié)果為深入探析miRNA在血吸蟲(chóng)凋亡中的調(diào)節(jié)作用，日本血吸蟲(chóng)與宿主的相互作用以及開(kāi)發(fā)抗日本血吸蟲(chóng)新藥物奠定了基礎(chǔ)。
　　二、日本血吸蟲(chóng)感染不同適宜性嚙齒類(lèi)宿主后組織miRNA表達(dá)譜變化
　　BALB/c小鼠是日本血吸蟲(chóng)的適宜宿主。本研究利用miRNA芯片技術(shù)，檢測(cè)日本血吸蟲(chóng)感染前和感染10天后小鼠的miRNA表達(dá)譜變化，共檢測(cè)到220個(gè)miRNA，其中在肝臟、脾臟和肺臟上調(diào)差異表達(dá)的分別有8、8和28個(gè)，下調(diào)差異表達(dá)的分別

9、有3、5和23個(gè)。這些差異表達(dá)miRNA分子的功能主要集中于免疫應(yīng)答、營(yíng)養(yǎng)代謝、細(xì)胞分化、凋亡及其他信號(hào)通路。對(duì)這些差異表達(dá)miRNA的靶基因進(jìn)行GO分類(lèi)和KEGG分析，表明靶基因與多個(gè)信號(hào)通路有關(guān)，如Toll-like受體信號(hào)通路、TGF-β信號(hào)通路。研究結(jié)果揭示了miRNA在日本血吸蟲(chóng)早期感染中可能發(fā)揮了重要的生物學(xué)功能，并影響著日本血吸蟲(chóng)在不同適宜性宿主體內(nèi)的生長(zhǎng)發(fā)育及存活。
　　大鼠是日本血吸蟲(chóng)的非適宜宿主，本研究使用了包

10、含大鼠成熟體miRNA的芯片，分析大鼠在感染血吸蟲(chóng)前和感染10天后肝臟、脾臟和肺臟的miRNA的表達(dá)譜差異。結(jié)果在大鼠肝臟、脾臟和肺臟中分別鑒定了16個(gè)、61個(gè)和10個(gè)差異表達(dá)miRNA。對(duì)這些差異表達(dá)miRNA分析表明，其功能覆蓋了多個(gè)生物學(xué)過(guò)程，如Wnt和MAPK信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞內(nèi)分化和脂肪細(xì)胞及紅細(xì)胞的分化。研究表明miRNA在血吸蟲(chóng)感染大鼠中的調(diào)節(jié)作用與在小鼠和東方田鼠中的調(diào)節(jié)作用均存在較大的差別，這最終也影響了血吸蟲(chóng)在大鼠體內(nèi)的

11、生長(zhǎng)發(fā)育狀況。
　　東方田鼠是至今報(bào)道的唯一對(duì)日本血吸蟲(chóng)具有天然抗性的哺乳類(lèi)動(dòng)物宿主，東方田鼠對(duì)日本血吸蟲(chóng)的天然抗性可能與miRNA介導(dǎo)的基因表達(dá)及調(diào)控相關(guān)。HE染色分析表明，東方田鼠感染日本血吸蟲(chóng)后不同組織病理變化與BALB/c小鼠差異顯著;miRNA芯片分析表明，在東方田鼠和小鼠肝臟、脾臟和肺臟組織中共檢測(cè)到388個(gè)miRNA，分別有11、25和28個(gè)miRNA分子呈現(xiàn)差異表達(dá)。這些研究結(jié)果顯示在東方田鼠體內(nèi)miRNA特異性地