日本血吸蟲童蟲在不同敏感性宿主體內(nèi)差異表達(dá)蛋白的研究.pdf

1、血吸蟲?。⊿chistosomiasis）是由血吸蟲(Schistosome)感染引起的一種分布廣泛，危害嚴(yán)重的人畜共患寄生蟲病．全球有74個(gè)國家和地區(qū)流行血吸蟲病，有5-6億人受到威脅，約2億人感染血吸蟲?。?dāng)前血吸蟲的防治策略主要以化療藥吡喹酮來進(jìn)行治療，從而減少發(fā)病率．但是吡喹酮又不能避免重復(fù)感染，而且近年來曼氏血吸蟲已經(jīng)有吡喹酮抗性蟲株的報(bào)道，耐藥蟲株的出現(xiàn)引起了人們的不安與高度關(guān)注．因此，加強(qiáng)抗血吸蟲疫苗的開發(fā)和新藥物靶標(biāo)的篩

2、選顯得格外重要．
　　 在我國，日本血吸蟲（Schistosoma japonicum）可以感染40多種哺乳動(dòng)物，山羊、黃牛、綿羊、兔子和小鼠等都是其易感宿主，但是另外一些哺乳動(dòng)物如大鼠等是日本血吸蟲的不易感宿主，在不易感宿主體內(nèi)，血吸蟲的發(fā)育率低而且蟲體較小．東方田鼠是目前為止唯一一種對(duì)日本血吸蟲具有抗性的宿主，日本血吸蟲尾蚴可以感染東方田鼠，感染之后蟲體發(fā)育遲緩，在感染尾蚴15天后，東方田鼠體內(nèi)基本上找不到存活的蟲體，感染4

3、2天后，東方田鼠體內(nèi)檢查不到日本血吸蟲成蟲，不同的宿主能夠?yàn)槿毡狙x提供不同的生存環(huán)境，影響到蟲體的生存和發(fā)育，不同宿主環(huán)境中生長的蟲體在蛋白表達(dá)上也會(huì)存在差異，而這些差異表達(dá)的蛋白可能是蟲體生存發(fā)育所需要的關(guān)鍵分子．因此找到在不同易感性宿主環(huán)境中日本血吸蟲生長發(fā)育差異的蛋白具有重要理論和實(shí)際意義．
　　 1、日本血吸蟲童蟲在不同敏感性宿主體內(nèi)差異表達(dá)蛋白的研究
　　 本文應(yīng)用熒光差異凝膠雙向電泳技術(shù)(2D-DIGE)

4、，對(duì)BALB/c小鼠、Wistar大鼠和東方田鼠體內(nèi)的10d日本血吸蟲童蟲的蛋白表達(dá)情況進(jìn)行了分析，通過DoCyder6.5軟件分析和匹配后，得到了1721個(gè)點(diǎn)適合進(jìn)行后續(xù)的差異分析．在大鼠體內(nèi)lOd童蟲蛋白和小鼠體內(nèi)10d童蟲蛋白的比較分析中發(fā)現(xiàn)，有39個(gè)蛋白點(diǎn)存在顯著性差異，其中有27個(gè)蛋白點(diǎn)在小鼠體內(nèi)10d童蟲中高表達(dá)，12個(gè)蛋白點(diǎn)低表達(dá)．在小鼠體內(nèi)10d童蟲蛋白和東方田鼠體內(nèi)10d童蟲蛋白的比較分析中發(fā)現(xiàn)，有21個(gè)蛋白點(diǎn)存在顯著

5、性差異，其中有13個(gè)蛋白點(diǎn)在小鼠體內(nèi)10d童蟲中高表達(dá)，8個(gè)蛋白點(diǎn)低表達(dá)．
　　 將分析膠與制備膠進(jìn)行比對(duì)挑點(diǎn)，最終共有44個(gè)差異表達(dá)蛋白能夠進(jìn)行后續(xù)的質(zhì)譜分析，將質(zhì)譜鑒定出的數(shù)據(jù)進(jìn)行搜庫比對(duì)，其中3個(gè)蛋白點(diǎn)沒有注釋信息，其余41個(gè)蛋白點(diǎn)經(jīng)過序列比對(duì)與去重復(fù)分析后發(fā)現(xiàn)，共代表了33種蛋白．
　　 為了驗(yàn)證2D-DIGE實(shí)驗(yàn)分析的可靠性，我們挑取了其中6個(gè)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行了實(shí)時(shí)定量分析，在基因水平上對(duì)其結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)

6、果顯示，實(shí)時(shí)定量的結(jié)果與2D-DIGE的結(jié)果基本一致．
　　 我們對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行了GO分類以及KEGG通路分析，結(jié)果顯示，在小鼠體內(nèi)10d童蟲和大鼠體內(nèi)10d童蟲的差異表達(dá)蛋白中，40％的差異蛋白在蛋白代謝途徑中，26%的差異蛋白在糖類代謝途徑中，13%的差異蛋白在RNA代謝途徑中，9%的差異蛋白與應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，其余的差異表達(dá)蛋白與蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、調(diào)節(jié)基因表達(dá)和細(xì)胞骨架蛋白有關(guān)。在小鼠體內(nèi)10d童蟲和東方田鼠體內(nèi)10d童蟲的差異表

7、達(dá)蛋白中，53%的差異蛋白在蛋白代謝途徑中，23%的差異蛋白在RNA代謝途徑中，其余的差異表達(dá)蛋白與糖類代謝途徑、核酸代謝途徑和細(xì)胞骨架蛋白有關(guān)。其中線粒體外膜轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物TOM34、蛋白酶體亞基、核內(nèi)核糖體異構(gòu)蛋白K和肌動(dòng)蛋白在易感宿主小鼠體內(nèi)高表達(dá)，而半胱氨酸蛋白酶抑制劑、醛縮酶和70kDa熱激蛋白在不易感宿主大鼠體內(nèi)或抗性宿主東方田鼠體內(nèi)高表達(dá)．
　　 本文首次對(duì)不同宿主體內(nèi)的日本血吸蟲10d童蟲進(jìn)行了蛋白質(zhì)組分析，為我們

8、更好的理解血吸蟲的生長發(fā)育機(jī)制提供了依據(jù)，同時(shí)也可為抗血吸蟲疫苗和潛在藥物靶標(biāo)的研究提供基礎(chǔ)．
　　 2、日本血吸蟲蛋白酶體a5和a2亞基基因的克隆、表達(dá)及免疫效果觀察
　　 本文利用RT-PCR技術(shù)從日本血吸蟲18 d童蟲中首次擴(kuò)增到蛋白酶體a5亞基基因（GcnBank accession FJ595238）．序列分析表明蛋白酶體a5亞基基因的ORF含747bp，編碼248個(gè)氨基酸，理論分子量27.38 kDa．同源性

9、分析結(jié)果顯示，該基因分別為日本血吸蟲蛋白酶體a5亞基，命名為SjPSMA5．實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)該基因在蟲體不同發(fā)育階段和不同宿主體內(nèi)10d童蟲中的表達(dá)情況進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，該基因在7d、13d、18d、23 d、32 d和42 d蟲體中都有表達(dá)，13d和32 d蟲體中的表達(dá)量高于其他時(shí)期；在小鼠體內(nèi)的lOd童蟲中的表達(dá)量要高于大鼠和東方田鼠體內(nèi)的lOd童蟲中的表達(dá)量．構(gòu)建了該基因的原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)-SjPSMA5，在大腸

10、桿菌系統(tǒng)中成功獲得了表達(dá)，重組蛋白rSjPSMA5以包涵體形式存在．Western印跡顯示表達(dá)的重組蛋白rSjPSMA5能被日本血吸蟲成蟲粗抗原免疫血清所識(shí)別，并且能檢測到天然狀態(tài)下該蛋白的存在．免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SjPSMA5蛋白在蟲體各組織器官內(nèi)廣泛分布．應(yīng)用重組蛋白免疫BALB/c小鼠后，產(chǎn)生了較高的特異性抗體水平，并且CD4+細(xì)胞數(shù)量顯著升高，誘導(dǎo)了23.29%的減蟲率和35.23%的肝臟減卵率，
　　 本文利用RT

11、-PCR技術(shù)從日本血吸蟲18 d童蟲中擴(kuò)增到蛋白酶體0.2亞基基因（GenBank accession AY813725）．序列分析表明蛋白酶體a2亞基基因的ORF含708bp，編碼235個(gè)氨基酸，理論分子量25.84 kDa．同源性分析結(jié)果顯示，該基因?yàn)槿毡狙x蛋白酶體a2亞基，命名為SjPSMA2。實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)該基因在蟲體不同發(fā)育階段和不同宿主體內(nèi)10d童蟲中的表達(dá)情況進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，該基因在7d、13d、18d、23

12、d、32 d和42 d蟲體中都有表達(dá)，7d和23d蟲體表達(dá)量低于其他幾個(gè)時(shí)期；在小鼠體內(nèi)的10d童蟲中的表達(dá)量要略高于大鼠和東方田鼠體內(nèi)的lOd童蟲中的表達(dá)量．構(gòu)建了該基因的原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)-SjPSMA2，在大腸桿菌系統(tǒng)中成功獲得了表達(dá)，重組蛋白rSjPSMA2以包涵體形式存在．Western印跡顯示表達(dá)的重組蛋白rSjPSMA2能被日本血吸蟲成蟲粗抗原免疫血清所識(shí)別，并且能檢測到天然狀態(tài)下該蛋白的存在．免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

13、表明，SjPSMA2蛋白在蟲體各組織器官內(nèi)廣泛分布，應(yīng)用該重組蛋白免疫BALB/c小鼠后，產(chǎn)生了較高的特異性抗體水平，誘導(dǎo)了12.33%的減蟲率和35.23%的肝臟減卵率．
　　 綜上所述，SjPSMA5和SjPSMA2都可作為潛在的抗血吸蟲病的疫苗候選分子，SjPSMA5和SjPSMA2基因及表達(dá)產(chǎn)物的獲得，為探索蛋白酶體在血吸蟲生長發(fā)育中的作用提供了重要基礎(chǔ)．
　　 3、日本血吸蟲硫氧還蛋白過氧化物酶的特性研究

14、>　　 根據(jù)GenBank上公布的日本血吸蟲硫氧還蛋白過氧化物酶(thioredoxinperoxidse，TPx)基因的登陸號(hào)AY813893，對(duì)其序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明，該基因的ORF含681bp，編碼227個(gè)氨基酸，理論分子量25.09 kDa．信號(hào)肽預(yù)測顯示，該基因的前24個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列．設(shè)計(jì)去除信號(hào)肽序列的引物，利用RT-PCR技術(shù)從日本血吸蟲42 d童蟲中擴(kuò)增到約600bp的產(chǎn)物．測序結(jié)果表明，擴(kuò)增片斷為日本血吸蟲硫

15、氧還蛋白過氧化物酶去除信號(hào)肽后的ORF序列．實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)該基因在蟲體不同發(fā)育階段和不同宿主體內(nèi)10d童蟲中的表達(dá)情況進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，該基因在蟲卵、尾蚴、7d、13d、21d、28 d、35 d和42 d蟲體中都有表達(dá)，7d、13d和42 d雌蟲中表達(dá)量高于其他幾個(gè)時(shí)期；在大鼠體內(nèi)的10d童蟲中的表達(dá)量要高于小鼠和東方田鼠體內(nèi)的10d童蟲中的表達(dá)量．構(gòu)建了該基因的原核表達(dá)質(zhì)粒pET2Sa(+)-SjTPx，在大腸桿菌系統(tǒng)中成功獲