大鼠胰腺發(fā)育過程中胰島素釋放功能完善及其機制的研究.pdf

1、目的：研究大鼠胰腺發(fā)育不同階段基因表達譜，分析胰島素合成和釋放過程中的關鍵基因表達特點，并明確胚胎發(fā)育正常及異常大鼠胰島素釋放功能的完善過程及其胰島功能異常的機制。 方法：1、應用顯微分離及提取技術獲得胚胎發(fā)育12.5天(E12.5)、15.5天(E15.5)、18.5天(E18.5)、新生大鼠(N)、出生后21天(P21)及成年(A)SD大鼠的胰腺組織。 2、利用Affymetrix公司生產(chǎn)的高密度寡核苷酸芯片檢測大鼠

2、發(fā)育各階段胰腺內(nèi)外分泌基因表達譜；用生物信息學技術，結合UCSC、TRANSFAC、NCBI等公共數(shù)據(jù)庫進行檢索，對各時期芯片結果尤其是胰島素合成及釋放相關基因的表達進行分析；并用RT-PCR及realtimePCR對芯片結果進行驗證。 3、運用RT-PCR、Westernblot、免疫組化、免疫熒光等技術確定胰島素釋放關鍵基因的定位及其基因、蛋白表達情況。 4、腹腔葡萄糖耐量試驗(IPGTT)檢測大鼠胰島功能，ELIS

3、A法測定血中胰島素濃度。 5、從大鼠胚胎發(fā)育14天開始給予孕鼠半量飲食直至新生鼠出生，造成宮內(nèi)發(fā)育遲緩動物模型，宮內(nèi)發(fā)育遲緩新生大鼠出生后，部分給予正常哺乳，部分繼續(xù)給與半量飲食，觀察其體重和胰腺重量的變化，提取宮內(nèi)發(fā)育遲緩新生大鼠胰腺組織，檢測胰島素合成釋放相關基因、蛋白的表達；經(jīng)鼻尖采血收集新生后不同天數(shù)的鼠血，腹腔葡萄糖耐量試驗觀察其胰島功能并測定血胰島素水平的變化。 結果：1、RAE230A芯片共包含15851個

4、基因，E12.5、E15.5、E18.5、N、A等時期大鼠基因的檢出率分別為60.3﹪、66.5﹪、64.4﹪、63.4﹪、40.3﹪。將所有基因歸納為以下8類：(1)轉(zhuǎn)錄因子類；(2)酶類；(3)信號轉(zhuǎn)導類；(4)激素、受體、生長因子類；(5)原癌基因類；(6)細胞骨架類；(7)凝血、免疫和其它類；(8)表達序列標識(est)。 2、大鼠胚胎胰腺發(fā)育至E12.5時，細胞分化相關基因高度表達；E18.5時，內(nèi)分泌典型胰島結構及外

5、分泌腺泡、導管結構已基本形成；E18.5與E15.5相比較，E18.5時功能細胞分化相關基因如hnf6、ISL1、Pdx-1表達明顯下降，而細胞代謝功能調(diào)節(jié)基因如hnf1a、hnf4a表達明顯上調(diào)，胰島素基因、胰淀粉酶基因的表達分別上調(diào)16倍、2倍以上；此后，主要是內(nèi)外分泌胰腺功能完善相關基因高表達。 3、在胰島素合成及釋放相關基因中，胰島素基因及其特異性轉(zhuǎn)錄因子在大鼠E12.5-E15.5天時即開始有表達，以后胰島素基因持續(xù)存

6、在且表達增多；作為胞吐分子構件及調(diào)節(jié)的相關基因syntaxin-1a、vamp-2、Rab3a、munc13-1等從E15.5天左右開始出現(xiàn)，以后表達量亦增多；而葡萄糖刺激的胰島素分泌(GSIS)相關的基因中，葡萄糖轉(zhuǎn)運體(Glut2)在胚胎早期開始表達，而葡萄糖激酶(GCK)則出現(xiàn)于胚胎中晚期。 4、自E18.5即檢測到血中胰島素的存在，隨著胚胎的發(fā)育，血胰島素濃度逐漸升高。正常新生大鼠空腹血糖正常，但出生一周以前的大鼠對葡萄

7、糖負荷不能耐受，餐后血糖高，出生一周以后腹腔葡萄糖耐量試驗才逐漸趨于正常。 5、宮內(nèi)發(fā)育遲緩新生大鼠比正常新生大鼠體重及胰腺重量明顯下降，血糖水平高、血胰島素水平降低，同時胰島素釋放相關基因munc13-1，syntaxin1a等的表達減少，葡萄糖耐量異常。給予正常飲食后，胰島功能能逐漸恢復，但IPGTT不是在出生后一周，而是需更多時日才逐漸趨于正常。 6、Munc13-1表達于胰島β細胞，隨著胚胎發(fā)育期胰島素分泌的增多

8、表達也增加；宮內(nèi)發(fā)育遲緩時，胰島素分泌減少，munc13-1的基因及蛋白表達量亦比正常對照組明顯減少。 結論：1、E12.5～E15.5時，胰腺內(nèi)外分泌部分分化旺盛，E15.5～E18.5時，胰腺內(nèi)外分泌部分化已基本完成，功能細胞的代謝調(diào)節(jié)功能開始完善，此后，以功能完善為主。 2、大鼠胚胎胰腺發(fā)育早中期開始即已具備胰島素的合成及分泌能力，而葡萄糖刺激的胰島素分泌能力在胚胎中晚期才出現(xiàn)。 3、雖然大鼠胚胎發(fā)育中晚期