抗雞源隱孢子蟲卵黃抗體的制備及應(yīng)用研究.pdf

1、卵黃免疫球蛋白，又稱卵黃抗體，是禽類血清中的IgG進(jìn)入到卵黃中而形成的一類免疫球蛋白。由于雞屬于非哺乳動(dòng)物，與人類親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，因此對(duì)人類的病原體及哺乳動(dòng)物高度保守蛋白質(zhì)能產(chǎn)生強(qiáng)免疫應(yīng)答。另外，IgY的熱、酸穩(wěn)定性好，4℃保存5年或室溫放置6個(gè)月，抗體活性仍無(wú)明顯下降。這種雞源的特異性多克隆抗體(IgY)選材方便、提取較易、又可規(guī)模化生產(chǎn)，在食品及口服被動(dòng)免疫治療領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用前景。 隱孢子病是由隱孢子蟲弓l起的一種以腹瀉為

2、主要臨床表現(xiàn)的人獸共患原蟲病。呈世界性分布，已經(jīng)被列為最常見的6種腹瀉病之一。多年來(lái)雖然國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)隱孢子蟲病的防治研究作了很多工作，但尚未篩選出一種特效藥物治療隱孢子蟲感染。因此仍有必要對(duì)隱孢子蟲病的防治做進(jìn)一步的研究。 本研究的目的是制備抗隱孢子蟲特異性卵黃抗體，并初步探討其對(duì)隱孢子蟲病的防治作用。 利用實(shí)驗(yàn)室保存的雞源隱孢子蟲卵囊，以改進(jìn)的Sheather蔗糖梯度離心法提純卵囊，低速離心結(jié)合濾膜微濾除菌后，通過(guò)反復(fù)

3、凍融和超聲波處理的全卵囊抗原，以福氏完全和非完全佐劑制備免疫抗原，采用抗原增加的梯度免疫法對(duì)健康雞進(jìn)行免疫，共免六次；酸化水稀釋-鹽析法分離純化卵黃抗體，并比較各鹽析法提純卵黃抗體的效果。建立了檢測(cè)抗隱孢子蟲特異性卵黃抗體的間接ELISA方法，并通過(guò)ELISA系統(tǒng)檢測(cè)了抗體效價(jià)，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定純度，紫外分光光度法測(cè)定其蛋白濃度。結(jié)果顯示：水稀釋二步硫酸銨鹽析法取得了良好的提純效果，蛋白濃度為9.44m

4、g/ml，每枚雞蛋最低可提供大約94.4mg抗體。采用間接ELISA對(duì)獲得的卵黃抗體進(jìn)行鑒定。其具有隱孢子蟲屬特異性。SDS-PAGE結(jié)果顯示，IgY與血清IgY具有同源性，是從血清中轉(zhuǎn)移到卵黃中的免疫球蛋白。間接ELISA方法測(cè)定IgY的穩(wěn)定性，將IgY放置在不同的環(huán)境條件下：①將IgY放入25℃-80℃水浴中加熱15min后取出，測(cè)定效價(jià)；②調(diào)不同pH值，置37℃恒溫箱孵育2h，取出以NaOH和HCL再分別將樣品的pH值調(diào)至7.2～

5、7.4，測(cè)定抗體樣品的效價(jià)。IgY在pH4～10活性無(wú)明顯變化；在65℃時(shí)活性無(wú)影響。表明IgY具有良好的穩(wěn)定性，為臨床應(yīng)用提供了可靠的依據(jù)。應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)研制出的抗隱孢子蟲特異性IgY，防治雛雞隱孢子蟲感染，試驗(yàn)分七組：空白對(duì)照、感染組、陰性IgY治療組、抗貝氏隱孢子蟲抗體(IgY)治療組、抗牛安氏隱孢子卵黃抗體(IgY)高、中、低治療組，灌喂抗體第2天感染C.baileyi卵囊3.2×106個(gè)·只-1。觀察各組卵囊的變化情況、臨床癥狀、

6、法氏囊指數(shù)、對(duì)增重的影響。結(jié)果表明：陰性治療組與感染組在潛隱期、高峰期、持續(xù)期(20d)、基本一致，但排卵囊強(qiáng)度陰性IgY治療組較感染對(duì)照組稍有降低。陰性IgY治療組與牛安氏隱孢子蟲特異性IgY抗體治療的三個(gè)不同劑量組進(jìn)行比較，3個(gè)治療組均在第12d達(dá)到排卵囊高峰，卵囊排出量較陰性IgY治療組低，其中高劑量治療的降低幅度最大，在卵囊持續(xù)期的長(zhǎng)短等方面：牛安氏IgY抗體低劑量治療組從感染后第3d開始排卵囊，卵囊排出數(shù)量較陰性IgY治療組平

7、均低12％，排卵囊持續(xù)期19d，比陰性IgY治療組少了1d；中劑量治療組卵囊排出數(shù)量較陰性IgY治療組平均低28％，排卵囊持續(xù)期18d，比陰性IgY治療組少了2d；高劑量治療組卵囊排出數(shù)量較陰性IgY治療組平均低43％，排卵囊持續(xù)期18d，比陰性IgY治療組少了2d；表明應(yīng)用牛安氏隱孢子蟲特異性IgY抗體預(yù)防和治療可使卵囊的排出的數(shù)量減少，持續(xù)期減短。從另一側(cè)面反映出對(duì)卵囊的抑制作用。且呈劑量相關(guān)性。 抗貝氏隱孢子蟲的特異性高免

8、卵黃抗體(IgY)治療組與牛安氏隱孢子蟲特異性IgV抗體治療的三個(gè)不同劑量組進(jìn)行比較：卵囊排出數(shù)量較三個(gè)治療組平均低45％，排卵囊持續(xù)期18d。表明抗貝氏隱孢子蟲的特異性高免卵黃抗體(IgY)在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人工感染治療試驗(yàn)中顯示良好的療效，能顯著減少雞群0PG值。 本實(shí)驗(yàn)成功制備出的高活性的抗隱孢子蟲特異性IgY，對(duì)提高雛雞免疫功能、特異性防治隱孢子蟲感染具有明顯的作用。且牛安氏隱孢子蟲特異性IgY抗體對(duì)雞源貝氏隱孢子蟲病具有交叉保