抗SEA卵黃抗體的制備及檢測(cè)日本血吸蟲(chóng)循環(huán)抗原的初步研究.pdf

1、血吸蟲(chóng)病的免疫診斷主要包括抗體的檢測(cè)和循環(huán)抗原的檢測(cè)。檢測(cè)抗體特異性和敏感性均較好，但是抗體在治愈后仍在血清中存在較長(zhǎng)的時(shí)間，難以區(qū)分現(xiàn)癥感染與既往感染，即療效考核價(jià)值不高；循環(huán)抗原的檢測(cè)可反映活動(dòng)性感染，具有較好的病原檢測(cè)意義和療效考核價(jià)值，但是目前血吸蟲(chóng)循環(huán)抗原的檢測(cè)特異性不高，對(duì)慢性感染者的敏感性也低。因此，建立敏感又特異的具有療效考核價(jià)值的循環(huán)抗原檢測(cè)方法是當(dāng)前血吸蟲(chóng)病基礎(chǔ)研究中的一個(gè)熱點(diǎn)。 卵黃抗體(immunoglo

2、bulin Y，IgY)是特定抗原免疫母雞后產(chǎn)生的相應(yīng)抗體累積并轉(zhuǎn)移至卵黃中而形成，且是卵黃中主要的免疫球蛋白類(lèi)。與哺乳動(dòng)物類(lèi)IgG相比，IgY具有親和力高、制備簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)、穩(wěn)定性好、不激活補(bǔ)體、不結(jié)合類(lèi)風(fēng)濕因子，也不與哺乳動(dòng)物類(lèi)免疫球蛋白分子的Fc受體結(jié)合等優(yōu)點(diǎn)，此外由于與哺乳動(dòng)物種系發(fā)生距離遠(yuǎn)，IgY不會(huì)與哺乳動(dòng)物類(lèi)免疫球蛋白發(fā)生血清學(xué)交叉反應(yīng)，將其用作免疫診斷試劑可以減少假陽(yáng)性，提高檢測(cè)敏感性和特異性。 目的：應(yīng)用抗血吸蟲(chóng)可

3、溶性蟲(chóng)卵抗原(soluble egg antigen，SEA)多克隆IgY和酶標(biāo)抗SEA單克隆抗體NP28-5B組合，建立一種雙抗體夾心法(sandwich ELISA，S-ELISA)檢測(cè)血吸蟲(chóng)循環(huán)抗原，以探討IgY用于診斷血吸蟲(chóng)病診斷的應(yīng)用價(jià)值。 方法： 1.抗日本血吸蟲(chóng)SEA雞卵黃抗體的制備與鑒定：用日本血吸蟲(chóng)SEA經(jīng)翅膀下靜脈和皮下免疫25周齡海蘭母雞4次(首次劑量為60μg/只，加強(qiáng)劑量為30μg/只)，每次間

4、隔10d。取免疫前和首次免疫后35d的雞蛋卵黃，分別用水稀釋法提取純化IgY。BCA法(2.2’-Bicinohoninic acid.BCA)測(cè)定純化后IgY的濃度，并采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析其相對(duì)分子量和純度，間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(indirect-ELIsA)檢測(cè)IgY的活性與特異性。 2.抗SEA單克隆抗體NP28-5B的制備及酶標(biāo)記：取感染日本血吸蟲(chóng)尾蚴的BALB/c小鼠脾細(xì)胞與同系小鼠骨髓瘤細(xì)胞

5、SP2/0融合。采用間接ELISA法篩選陽(yáng)性克隆，陽(yáng)性孔細(xì)胞經(jīng)反復(fù)亞克隆，至所有雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)孔的培養(yǎng)上清均能與SEA產(chǎn)生陽(yáng)性反應(yīng)為止，此時(shí)確認(rèn)抗SEA單克隆抗體NP28-5B細(xì)胞系建立。經(jīng)傳代培養(yǎng)后，收集雜交瘤細(xì)胞上清，用50％硫酸銨沉淀后，溶解于10mM PBS(PH7.4)，充分透析后，凍存于-70℃?zhèn)溆谩＠备^(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記NP28-5B(簡(jiǎn)易過(guò)碘酸鈉法)。 3.IgY檢測(cè)日本血吸蟲(chóng)循環(huán)抗原雙抗體夾心法的建立：以

6、純化的雞IgY作為捕獲抗體，以HRP標(biāo)記的NP28-5B為檢測(cè)抗體建立雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(S-ELISA)。運(yùn)用正交試驗(yàn)對(duì)所建立的方法從包被抗體濃度、血清孵育時(shí)間、酶標(biāo)抗體濃度和酶標(biāo)抗體孵育時(shí)間四個(gè)方面進(jìn)行優(yōu)化。并和常規(guī)檢測(cè)抗體的SEA-ELISA同時(shí)檢測(cè)若干份急、慢性血吸蟲(chóng)病人和健康人血清。 4. 感染血清來(lái)源：9份急性血吸蟲(chóng)病人血清和45份慢性血吸蟲(chóng)病人血清分別采自江西九江都昌縣血防所和云南省大理白族自治州巍山縣鼠