抗鉤蟲(chóng)特異性卵黃抗體的制備與鑒定及其抗鉤蚴作用研究.pdf

1、目的：鉤蟲(chóng)病是全球發(fā)展中國(guó)家常見(jiàn)的腸道寄生蟲(chóng)病，反復(fù)藥物驅(qū)蟲(chóng)導(dǎo)致耐藥危險(xiǎn)性增加，而藥物的毒副作用也限制了化療藥物在孕婦及嬰兒患者中的使用。因此，單純依靠驅(qū)蟲(chóng)藥物的防治方法已經(jīng)不能完全適應(yīng)現(xiàn)階段全球鉤蟲(chóng)病的防治工作，安全、有效的抗鉤蟲(chóng)病替代藥物或者功能性食品有待于研制。本課題收集鉤蟲(chóng)病患者驅(qū)蟲(chóng)后排出的鉤蟲(chóng)成蟲(chóng)，制備鉤蟲(chóng)成蟲(chóng)抗原(AWA)，免疫25w產(chǎn)蛋海蘭母雞，制備抗鉤蟲(chóng)成蟲(chóng)特異性卵黃抗體(IgY)并鑒定。動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)抗體效價(jià)，大量純化效價(jià)較

2、高階段IgY，通過(guò)體內(nèi)、體外試驗(yàn)分析特異性IgY的抗蚴作用，為進(jìn)一步研制抗鉤蟲(chóng)藥物或功能性食品奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：應(yīng)用飽和鹽水漂浮法加水洗沉淀法篩查安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院住院患者23人，收集4位糞檢陽(yáng)性患者藥物驅(qū)蟲(chóng)后1-5d全程糞便，水洗過(guò)篩收集成蟲(chóng)，制備AWA保存?zhèn)溆?。?gòu)買(mǎi)未經(jīng)免疫的海蘭母雞雛雞，養(yǎng)至25W產(chǎn)蛋。每只母雞以200ugAWA進(jìn)行皮下加肌肉多點(diǎn)注射免疫，初次免疫后28d給予第二次免疫，間隔10d進(jìn)行第三次免疫

3、。收集免疫前、后雞蛋，標(biāo)記后4℃保存?zhèn)溆?。水稀釋法粗提抗鉤蟲(chóng)IgY抗體，鹽析法純化抗體，SDS-PAGE和Western-blotting進(jìn)行鑒定。間接ELISA法測(cè)定抗體效價(jià)，選取效價(jià)最高時(shí)間段的雞蛋，大量提取純化IgY抗體4℃保存?zhèn)溆谩２捎酶牧技犹俸裢科ǎ↘ato-Katz 法）檢獲安徽省蒙城縣重度鉤蟲(chóng)感染患者，收集患者糞便，分別進(jìn)行固體培養(yǎng)基濾紙法鉤蚴培養(yǎng)和試管濾紙法鉤蚴培養(yǎng)。分別收集鉤蟲(chóng)三期幼蟲(chóng)(L3)，進(jìn)行體外L3期鉤蚴與3

4、0％，50％和70％濃度的IgY抗體分別共培養(yǎng)以及小鼠腹腔內(nèi)L3期鉤蚴與IgY抗體共培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察體外共培養(yǎng)后鉤蚴形態(tài)，并進(jìn)行鉤蚴存活率統(tǒng)計(jì)分析。透射電鏡觀察小鼠腹腔內(nèi)抗體共培養(yǎng)鉤蚴形態(tài)，倒置顯微鏡下根據(jù)中性粒細(xì)胞黏附程度的不同對(duì)鉤蚴進(jìn)行分級(jí)計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。利用IgY抗體和FITC標(biāo)記的抗雞IgY二抗進(jìn)行間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)，觀察鉤蟲(chóng)成蟲(chóng)抗原在鉤蚴體表的分布特點(diǎn)。
　　 結(jié)果：制備的鉤蟲(chóng)AWA濃度為1.21mg/ml。水稀

5、釋粗提、鹽析法純化得到的IgY，經(jīng)Lowry法測(cè)得的濃度為1.8mg/ml。SDS-PAGE檢測(cè)IgY分子量與理論值一致。Western-blotting顯示，免疫后的IgY與AWA可以相互識(shí)別，而免疫前的IgY則不能識(shí)別成蟲(chóng)抗原蛋白。間接ELISA法測(cè)定抗體效價(jià)，初次免疫后10d左右產(chǎn)生抗體，隨著時(shí)間推移，抗體滴度逐漸上升，至免疫后55d 達(dá)到最高峰，效價(jià)達(dá)到1:10000以上。不同產(chǎn)蛋母雞之間抗體滴度存在個(gè)體差異。用EGG stra

6、ctTM IgY Purification System純化試劑盒大量純化IgY，經(jīng)Lowry法測(cè)得的濃度在5.9-10.1mg/ml之間。鉤蚴與IgY體外共培養(yǎng)，鉤蚴體表形成絮狀或顆粒狀附著物，絮狀物纏繞蟲(chóng)體，使蟲(chóng)體活動(dòng)受限；鉤蚴存活率統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明：50％及70％濃度的IgY抗體能夠?qū)︺^蚴的存活產(chǎn)生影響。小鼠腹腔內(nèi)鉤蚴與抗體共培養(yǎng)顯示，IgY抗體能夠增加中性粒細(xì)胞對(duì)鉤蚴的趨化、黏附作用。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，蟲(chóng)體表膜腫脹、粗糙，橫紋間相

7、互的擠壓，表膜及肌層電子密度不均勻。免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示，鉤蚴表膜上存在著與鉤蟲(chóng)成蟲(chóng)相同的抗原組分，利用成蟲(chóng)粗抗原免疫母雞得到的IgY抗體可與鉤蚴表膜上的抗原結(jié)合。
　　 結(jié)論：本研究成功大量制備了抗鉤蟲(chóng)成蟲(chóng)特異性IgY抗體，具有良好的安全性和穩(wěn)定性，易于保存。我們發(fā)現(xiàn)IgY抗體可與鉤蚴表膜抗原結(jié)合，能夠增加中性粒細(xì)胞對(duì)鉤蚴的趨化、黏附作用；IgY抗體對(duì)蟲(chóng)體表膜有損傷作用，高濃度IgY抗體影響鉤蚴的存活率。表明，特異性IgY抗體對(duì)鉤