抗鉤蟲特異性卵黃抗體的制備與鑒定及其抗鉤蚴作用研究.pdf

1、目的：鉤蟲病是全球發(fā)展中國家常見的腸道寄生蟲病，反復藥物驅(qū)蟲導致耐藥危險性增加，而藥物的毒副作用也限制了化療藥物在孕婦及嬰兒患者中的使用。因此，單純依靠驅(qū)蟲藥物的防治方法已經(jīng)不能完全適應現(xiàn)階段全球鉤蟲病的防治工作，安全、有效的抗鉤蟲病替代藥物或者功能性食品有待于研制。本課題收集鉤蟲病患者驅(qū)蟲后排出的鉤蟲成蟲，制備鉤蟲成蟲抗原(AWA)，免疫25w產(chǎn)蛋海蘭母雞，制備抗鉤蟲成蟲特異性卵黃抗體(IgY)并鑒定。動態(tài)監(jiān)測抗體效價，大量純化效價較

2、高階段IgY，通過體內(nèi)、體外試驗分析特異性IgY的抗蚴作用，為進一步研制抗鉤蟲藥物或功能性食品奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：應用飽和鹽水漂浮法加水洗沉淀法篩查安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院住院患者23人，收集4位糞檢陽性患者藥物驅(qū)蟲后1-5d全程糞便，水洗過篩收集成蟲，制備AWA保存?zhèn)溆?。購買未經(jīng)免疫的海蘭母雞雛雞，養(yǎng)至25W產(chǎn)蛋。每只母雞以200ugAWA進行皮下加肌肉多點注射免疫，初次免疫后28d給予第二次免疫，間隔10d進行第三次免疫

3、。收集免疫前、后雞蛋，標記后4℃保存?zhèn)溆?。水稀釋法粗提抗鉤蟲IgY抗體，鹽析法純化抗體，SDS-PAGE和Western-blotting進行鑒定。間接ELISA法測定抗體效價，選取效價最高時間段的雞蛋，大量提取純化IgY抗體4℃保存?zhèn)溆?。采用改良加藤厚涂片法（Kato-Katz 法）檢獲安徽省蒙城縣重度鉤蟲感染患者，收集患者糞便，分別進行固體培養(yǎng)基濾紙法鉤蚴培養(yǎng)和試管濾紙法鉤蚴培養(yǎng)。分別收集鉤蟲三期幼蟲(L3)，進行體外L3期鉤蚴與3

4、0％，50％和70％濃度的IgY抗體分別共培養(yǎng)以及小鼠腹腔內(nèi)L3期鉤蚴與IgY抗體共培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察體外共培養(yǎng)后鉤蚴形態(tài)，并進行鉤蚴存活率統(tǒng)計分析。透射電鏡觀察小鼠腹腔內(nèi)抗體共培養(yǎng)鉤蚴形態(tài)，倒置顯微鏡下根據(jù)中性粒細胞黏附程度的不同對鉤蚴進行分級計數(shù)，統(tǒng)計學分析。利用IgY抗體和FITC標記的抗雞IgY二抗進行間接免疫熒光實驗，觀察鉤蟲成蟲抗原在鉤蚴體表的分布特點。
　　 結(jié)果：制備的鉤蟲AWA濃度為1.21mg/ml。水稀

5、釋粗提、鹽析法純化得到的IgY，經(jīng)Lowry法測得的濃度為1.8mg/ml。SDS-PAGE檢測IgY分子量與理論值一致。Western-blotting顯示，免疫后的IgY與AWA可以相互識別，而免疫前的IgY則不能識別成蟲抗原蛋白。間接ELISA法測定抗體效價，初次免疫后10d左右產(chǎn)生抗體，隨著時間推移，抗體滴度逐漸上升，至免疫后55d 達到最高峰，效價達到1:10000以上。不同產(chǎn)蛋母雞之間抗體滴度存在個體差異。用EGG stra

6、ctTM IgY Purification System純化試劑盒大量純化IgY，經(jīng)Lowry法測得的濃度在5.9-10.1mg/ml之間。鉤蚴與IgY體外共培養(yǎng)，鉤蚴體表形成絮狀或顆粒狀附著物，絮狀物纏繞蟲體，使蟲體活動受限；鉤蚴存活率統(tǒng)計學分析表明：50％及70％濃度的IgY抗體能夠?qū)︺^蚴的存活產(chǎn)生影響。小鼠腹腔內(nèi)鉤蚴與抗體共培養(yǎng)顯示，IgY抗體能夠增加中性粒細胞對鉤蚴的趨化、黏附作用。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，蟲體表膜腫脹、粗糙，橫紋間相

7、互的擠壓，表膜及肌層電子密度不均勻。免疫熒光實驗顯示，鉤蚴表膜上存在著與鉤蟲成蟲相同的抗原組分，利用成蟲粗抗原免疫母雞得到的IgY抗體可與鉤蚴表膜上的抗原結(jié)合。
　　 結(jié)論：本研究成功大量制備了抗鉤蟲成蟲特異性IgY抗體，具有良好的安全性和穩(wěn)定性，易于保存。我們發(fā)現(xiàn)IgY抗體可與鉤蚴表膜抗原結(jié)合，能夠增加中性粒細胞對鉤蚴的趨化、黏附作用；IgY抗體對蟲體表膜有損傷作用，高濃度IgY抗體影響鉤蚴的存活率。表明，特異性IgY抗體對鉤