谷維素與黃連素聯(lián)合應用的藥效學及藥動學研究.pdf

1、世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計顯示高膽固醇血癥占心血管疾病的56％，每年均有4.4百萬人死于高膽固醇血癥。
　　 目前用于調脂的藥物有他汀類（即HMG-CoA還原酶抑制劑）、貝特類、煙酸、膽酸脂螯合劑等四大類，其中臨床實際應用最多的主要是他汀類和貝特類，但大劑量應用他汀類可使肝轉氨酶升高、肌痛及肌炎，若與貝特類藥物聯(lián)合應用更可能引起嚴重的肌炎及橫紋肌溶解，甚至發(fā)生急性腎功能衰竭;單獨應用貝特類藥物容易引起胃腸道不適及偶見皮膚瘙癢、蕁

2、麻疹、皮疹、脫發(fā)、頭痛、失眠和性欲減退等，長期服用可導致肝、腎功能損害。其次，上述兩種藥物價格昂貴，對于需要長期服藥的患者而言無疑是一種嚴重的經(jīng)濟負擔。因此，研發(fā)一種安全、有效、經(jīng)濟的降脂藥具有重要意義。
　　 黃連素(Berberine，BBR)常用于腸道感染;谷維素(Oryzanol，OZ)主要改善自主神經(jīng)功能，可減少內(nèi)分泌紊亂，改善精神神經(jīng)失調癥狀。臨床及體內(nèi)外實驗證明兩者均有顯著降血脂作用且臨床應用安全有效。BBR與目前

3、臨床上使用的調脂類藥物作用機理明顯不同，它是在基因轉錄后水平上，通過作用于3'UTR區(qū)域，穩(wěn)定及增加低密度脂蛋白受體的mRNA并提高其受體蛋白，提高密度脂蛋白的代謝從而達到降低血脂的目的。OZ則通過抑制體內(nèi)過氧化脂的產(chǎn)生、改變膽固醇酯酶和酰基輔酶的活力，降低膽固醇合成，增加膽固醇和膽酸排除，最終降低血脂濃度。雖然兩者降脂機制不同，但合用后具有明顯的協(xié)同作用，可降低各自的用藥劑量，減輕長期用藥帶來的毒副作用，同時OZ可以促進BBR的吸收，

4、提高BBR生物利用度。
　　 因此，本課題以BBR與OZ為研究對象，運用紫外分光光度法、液質聯(lián)用等方法進行藥學、藥效學及藥動學方面的系列研究。首先擬建立一種簡便、重現(xiàn)性好、可靠的含量測定方法同時測定BBR及OZ的含量，為后期制劑研發(fā)提供質控方法。同時建立高血脂動物模型研究BBR與OZ聯(lián)用的降脂效果，結合藥動學實驗考察比較BBR、OZ單獨與聯(lián)合使用后在大鼠體內(nèi)藥動學過程的變化，從藥動學層面探討B(tài)BR與OZ產(chǎn)生協(xié)同降脂作用的機理。另

5、外，由于OZ溶解度低，吸收差，生物利用度(BA)低，本課題亦分別從體外及體內(nèi)考察吐溫-80(TW-80)對OZ的增溶作用，為提高OZ生物利用度提供實驗依據(jù)。
　　 目的:1.含量測定。初步建立BBR與OZ的含量測定方法，為后期制劑的研究開發(fā)提供實驗基礎。
　　 2.藥效學實驗。建立高血脂大鼠模型，篩查BBR與OZ合用后降脂效果的最佳處方。
　　 3.藥動學實驗。通過藥動學實驗，考察比較BBR、OZ單用與合用后在大

6、鼠體內(nèi)的吸收、分布、消除等參數(shù)的變化情況，探討B(tài)BR與OZ的協(xié)同作用機理，從藥動學角度闡明兩藥合用后協(xié)同降脂的作用機制。
　　 4.OZ增溶作用初步研究。通過體內(nèi)外實驗考察TW-80對OZ的增溶作用。
　　 方法:1.參考《中國藥典》2010版、衛(wèi)生部部頒標準及相關文獻，采用雙波長紫外分光光度法同時測定BBR及OZ含量，并進行方法學考察。實驗選定OZ的測定波長為304nm，參比波長為369nm，BBR的測定波長為430n

7、m;通過BBR、OZ對照品建立標準曲線計算兩藥的含量。
　　 2.藥效學實驗:建立高血脂大鼠模型及降脂效果考察
　　 96只Wistar雄性大鼠適應性飼養(yǎng)1周，隨機取8只作為正常對照組，給予普通飼料，其余大鼠給予高脂飼料，4周后通過眼眶取血，檢測血清生化指標(總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)和低密度脂蛋白(LDL-C)，根據(jù)血清TC值將大鼠隨機分為高血脂模型組（高脂飼料）、陽性對照組（高脂飼

8、料+洛伐他汀組）及BBR單藥Ⅰ(0.01 g·kg-1)、BBRⅡ(0.03 g·kg-1)、BBRⅢ(0.1 g·kg-1)，OZ單藥Ⅰ(0.01 g·kg-1)、OZⅡ(0.03 g·kg-1)、OZⅢ(0.1 g·kg-1)、復方Ⅰ組(BBR0.025 g·kg-1+OZ0.005 g·kg-1)，復方Ⅱ組(BBR0.02 g·kg-1+OZ0.01 g·kg-1)、復方Ⅲ組(BBR0.015 g·kg-1+OZ0.015 g·k

9、g-1)。高血脂模型組及正常對照組每天灌胃(ig)給予生理鹽水，其余各組連續(xù)給藥4周，收集血清分別檢測TC、TG、LDL-C及HDL-C水平，考察BBR、OZ單用及聯(lián)用后的降脂效果。
　　 3.藥動學實驗
　　 取正常SD大鼠24只，體重(250-320g)，適應性飼養(yǎng)一周后，禁食12h，自由飲水，隨機分為4組，雌雄各半，分別以100 mg·kg-1(0.5％CMC-Na混懸)灌胃量給予大鼠OZ及BBR+OZ、TW-80

10、+OZ2，5，10，20，30，60，120，180，240，360，480及720 min后，給予BBR5，10，20，30，60，120，180，240，360，480，720及1440 min后，進行眼底靜脈叢取血(400μL)，肝素鈉抗凝，4000 r·min-14℃離心10min，精密量取100μL上清血漿置另一EP管中，-80℃冰箱保存待測。血樣經(jīng)過前處理后，采用液質聯(lián)用(LC/MS/MS)儀測定血漿中BBR與阿魏酸(Fem

11、lic，F(xiàn)A)的含量。測定結果用DAS2.0軟件進行分析，以擬合度和AIC值作為判斷標準，選擇適當?shù)姆渴夷Ｐ?，計算藥動學參數(shù)。
　　 4.OZ增溶作用初步研究。
　　 稱取適量OZ，體外采用0.1 mol·L-1 HC1、pH6.8的磷酸鹽緩沖液(PBS)以模擬胃液與腸液。用含有不同濃度TW-80的0.1 mol·L-1 HCl或PBS溶解，紫外分光光度計(UV-Vis)測定OZ在329nm波長處的吸光度，通過吸光度的變

12、化考察TW-80對OZ的增溶效果。體內(nèi)通過藥動學實驗考察添加TW-80后OZ的藥動學變化，從藥動學角度考察TW-80對OZ的增溶效果。
　　 結果:1.含量測定方法的測定
　　 OZ和BBR的線性范圍和相關系數(shù)分別為2.93～52.8 mg·L-1，R2=0.9999;2.1～37.8mg·L-1，R2=1.0000。對應的平均回收率和RSD為98.69％，2.36％(n=6);101.79％，2.01％（n=6）。

13、r>　　 2.藥效學實驗，高血脂大鼠模型的建立及降脂效果考察
　　 給予Wistar雄性大鼠高脂飼料4周，采用全自動生化分析儀檢測血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平，建立高血脂大鼠模型:與空白對照組比較，高血脂模型組中TC、LDL-C均顯著升高(P＜0.05），而HDL-C/TC(H/T)比值顯著降低(P＜0.05），模型復制成功;后給藥4周，檢測各項血脂指標，觀察藥物降脂效果:單藥Ⅱ、Ⅲ組，用藥前后對比，各指標均有明

14、顯改善，但Ⅱ與Ⅲ組之間的療效并無顯著差異。因此，綜合分析，BBRⅡ、OZⅡ的劑量最為合適，既有明顯療效，同時劑量相對較小。三種復方降脂藥均有療效，且效果相近;復方各組與單藥Ⅱ組及陽性組比較，療效雖無明顯差異，但從藥量分析，復方中各單藥用量比單藥組低，理論上降低毒副作用。復方Ⅰ中，BBR為單藥劑量5/6，OZ為1/6;復方Ⅱ中，將兩藥降至單藥劑量的一半;復方Ⅲ中BBR僅為單藥劑量的1/3，OZ為2/3。三組復方具有較好的療效。
　　

15、 3.藥動學實驗
　　 在電噴霧離子源ESI(-)及ESI(+)離子化條件下，采用多反應監(jiān)測(MRM)模式分別檢測FA(m/z193-＞134)及BBR(m/z336-＞292)。FA在3.082-400.32 ng·mL-1范圍內(nèi)(R2=0.9957)、BBR在5.008-127.2 ng·mL-1范圍內(nèi)(R2=0.9981)呈良好線性關系?？诜o藥后，BBR及OZ在大鼠體內(nèi)符合二室開放模型;單用和配伍給藥后，各藥動學參數(shù)均

16、具有明顯統(tǒng)計學差異。兩者配伍給藥后，F(xiàn)A t1/2β值(399.61+85.67)，Cmax值(285.65±57.16)及AUC0-∞值(79803.02±5757.05)均顯著高于單藥組中t1/2β值(197.74±54.84)， Cmax值(166.93±54.70)及AUC0-∞值(40420.60±15773.44);相應的，BBR的Cmax值(66.90±18.49)及AUC0-∞值(26606.41±3897.89)均高于

17、單藥組中Cmax值(65.99±13.34)及AUC0-t值(19197.90±2763.47)，但t1/2β值(351.80±71.35)低于單藥組中t1/2β值(561.42±97.19)。表明兩藥聯(lián)合應用后，F(xiàn)A分布加快，消除減慢，吸收增加，生物利用度提高;BBR分布減慢，消除加快，吸收增加，生物利用度提高。
　　 4.OZ增溶作用初步研究
　　 體外TW-80對OZ的增溶作用呈濃度依賴性(TW-80濃度為0～1％

18、)。體內(nèi)藥動學實驗結果表明，添加TW-80后，雖然FA的吸收并無提高，但Tmax延長、AUC0-∞顯著升高，提示TW-80能延長OZ的吸收及分布，提高OZ的生物利用度。
　　 結論:雙波長紫外分光光度法可同時測定BBR與OZ含量的測定及其質量控制方法。通過藥效實驗證明BBR聯(lián)合OZ可產(chǎn)生明顯的協(xié)同降脂作用，兩藥合用可減少BBR與OZ的用量，從理論上減少了大劑量單藥帶來的副作用。為進一步研究BBR與OZ合用協(xié)同降脂的作用機制，通過