血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-C在白血病發(fā)病機(jī)制中作用的基礎(chǔ)與臨床研究.pdf

1、本研究旨在基礎(chǔ)和臨床兩方面對(duì)VEGF-C的功能作進(jìn)一步探討。通過(guò)在體外構(gòu)建VEGF-C的真核細(xì)胞表達(dá)載體；體外細(xì)胞模型實(shí)驗(yàn)和裸鼠模型體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來(lái)探索VEGF-C是否通過(guò)VEGFR-2，3途徑影響白血病細(xì)胞增殖、存活及耐藥等生物學(xué)性狀；同時(shí)檢測(cè)VEGF-C及其受體在慢性粒細(xì)胞性白血病臨床標(biāo)本的表達(dá)并初步探討其意義。 1.VEGF-C真核表達(dá)載體的構(gòu)建及蛋白表達(dá)。 為研究VEGF-C蛋白在血液腫瘤細(xì)胞中的作用奠定基礎(chǔ)，采用RT

2、-PCR檢測(cè)本研究所保存的9種白血病細(xì)胞株及實(shí)體瘤、內(nèi)皮細(xì)胞cDNA，發(fā)現(xiàn)血液腫瘤細(xì)胞株中NB4，HEL，RPMl82263種細(xì)胞株細(xì)胞表達(dá)VEGFR-3基因，HEL、TF．1為VEGFR-2+細(xì)胞株。自行設(shè)計(jì)一對(duì)VEGF-C引物，RT-PCR從肺癌A549細(xì)胞株eDNA中擴(kuò)增VEGF-C，連接T載體并轉(zhuǎn)化TGI大腸桿菌；雙酶切及測(cè)序鑒定并連接到真核表達(dá)載體pcDNA3．1／V5-His-TOPO，構(gòu)建成pcDNA3．1／V5-His-

3、TOPO。VEGF-C真核表達(dá)載體；轉(zhuǎn)化TGl大腸桿菌擴(kuò)大培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定后4℃保存；將此真核表達(dá)載體并通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染至中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)。RT-PCR從轉(zhuǎn)染pcDNA3．1／VEGF-C的CHO細(xì)胞的cDNA中可擴(kuò)增出756bp大小VEGF-C基因片段，而轉(zhuǎn)空載體的CHO細(xì)胞cDNA中未擴(kuò)增出目的片段。WesternBlotting證實(shí)Penta-His抗體及抗VEGF-C的多抗均與CHO細(xì)胞上清重組

4、蛋白VEGF-C反應(yīng)，證明轉(zhuǎn)染成功。 2．DcDNA3．1N5-His-TOPO-VEGF-C轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞及其生物學(xué)作用。 VEGFs的受體主要表達(dá)在血管／淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，但近年來(lái)研究表明VEGFs的受體也在血液腫瘤細(xì)胞表達(dá)，但其對(duì)白血病細(xì)胞的作用尚不清楚。 本研究用脂質(zhì)體法將載有VEGF-CcDNA的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞株，空載體作陰性對(duì)照；無(wú)血清培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)，Westernblotting檢測(cè)培養(yǎng)上

5、清VEGF-C并濃縮。利用雞胚絨毛尿囊膜觀察CHONEGF-C細(xì)胞培養(yǎng)上清中重組VEGF-C可以誘發(fā)雞胚絨毛尿囊膜血管新生。RT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)出9例血液腫瘤細(xì)胞株中有4種細(xì)胞株表達(dá)VEGF-C受體(3種VEGFR-3+，2種VEGFR-2+)。采用噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，重組蛋白VEGF-C不僅可以促進(jìn)VEGFR-3+白血病細(xì)胞(NB4)增殖(P24h=0．006，P48h=0．018)，而對(duì)VEGFR-3一的

6、K562細(xì)胞則沒(méi)有作用。AnnixinV／PI雙染流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)顯示上清中VEGF-C具有抑制化療藥物(Etoposide、DNR、As203)誘導(dǎo)VEGFR-3+陽(yáng)性白血病細(xì)胞株(NB4)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(P=0．019，0．013，0．042)。結(jié)果提示重組蛋白VEGF-C不僅誘導(dǎo)血管新生，而且可能通過(guò)VEGFR-3信號(hào)途徑促進(jìn)白血病細(xì)胞增殖及抗凋亡，因此我們推測(cè)VEGF-C／VEGFR-3信號(hào)途徑可望作為白血病治療的靶點(diǎn)。

7、 3．轉(zhuǎn)染VEGF-CcDNA對(duì)NB4細(xì)胞增殖、分化與凋亡的影響。 多種腫瘤細(xì)胞包括血液腫瘤細(xì)胞可以分泌VEGFs。同時(shí)近年來(lái)研究表明也在血液腫瘤細(xì)胞表達(dá)VEGFs的受體，因此可能存在VEGFs通過(guò)VEGFR以一種自分泌形式影響血液腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)性狀。 為探討轉(zhuǎn)染VEGF-CcDNA對(duì)急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株(NB4細(xì)胞)增殖、ATRA誘導(dǎo)分化及化療藥介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用的影響，采用脂質(zhì)體法將重組表達(dá)載體(pc

8、DNA3．1-VEGF-C)和空質(zhì)粒pcDNA3．1轉(zhuǎn)染NB4細(xì)胞建立穩(wěn)定細(xì)胞株，并經(jīng)RT-PCR和Westernblotting鑒定其穩(wěn)定表達(dá)VEGF-C蛋白。MTT法作生長(zhǎng)曲線及集落形成實(shí)驗(yàn)顯示NB4／VEGF-C增殖能力顯著高于NB4/pcDNA3．1細(xì)胞。然而，NB4／VEGF-C細(xì)胞的生長(zhǎng)可以被FLT-4的特異性抑制劑MAZ51抑制。NB4／VEGF-C細(xì)胞經(jīng)ATRA誘導(dǎo)后，涂片染色作形態(tài)學(xué)分析顯示此細(xì)胞對(duì)抗ATRA介導(dǎo)的早幼

9、粒細(xì)胞分化成熟，同時(shí)FCM檢測(cè)細(xì)胞表面的CDllb表達(dá)量低于對(duì)照組，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)出NB4／VEGF-C細(xì)胞調(diào)控粒細(xì)胞分化基因C／EBP。基因含量?jī)H為對(duì)照組的1／32。NB4／VEGF-C細(xì)胞經(jīng)VP．16介導(dǎo)48h后AnnexinV／PI-FCM分析得出凋亡百分率(7．20-~2．52％)明顯低于NB4/pcDNA3．1細(xì)胞(16．07+3．58％)(P=0．005)，TUNEL法也證實(shí)NB4／VEGF-C細(xì)胞經(jīng)VP．16誘導(dǎo)的

10、細(xì)胞凋亡減少；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)bcl-2基因表達(dá)約為NB4/pcDNA3．1細(xì)胞的2．28倍。 因而，VEGF-C／VEGFR-3信號(hào)途徑以自分泌形式促進(jìn)白血病細(xì)胞增殖，抑制ATRA的NB4細(xì)胞分化及上調(diào)bcl-2基因來(lái)抑制化療藥介導(dǎo)的凋亡，推測(cè)VEGF-CNEGFR-3信號(hào)途徑在白血病疾病進(jìn)展中發(fā)揮重要作用并可望作為白血病治療的靶點(diǎn)。 4.轉(zhuǎn)染VEGF-CcDNA促進(jìn)裸鼠體內(nèi)NB4細(xì)胞種植瘤生長(zhǎng)及血管新生。

11、 體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)自身分泌的重組VEGF-C影響VEGFR-3+的NB4細(xì)胞生物學(xué)性狀，但由于體外實(shí)驗(yàn)條件是人為控制，結(jié)果難免受到非客觀因素影響，另外腫瘤細(xì)胞可能受到基質(zhì)相互關(guān)系的影響，因此裸鼠體內(nèi)NB4／VEGF-C細(xì)胞種植瘤模型的實(shí)驗(yàn)研究十分必要。 每組9只4～5周齡的BALB／c裸鼠，經(jīng)4Gy6~Co照射后腋窩皮下分別接種1×10’個(gè)NB4／VEGF-C、NB4/pcDNA3．1細(xì)胞，觀察成瘤性，3周后處死裸鼠。所有細(xì)胞在裸

12、鼠腋下均成瘤，NB4／VEGF-C細(xì)胞組腫瘤生長(zhǎng)速度快于NB4／pcDNA3．1組，NB4／VEGF-C細(xì)胞瘤體體積631．44+114．42mm3；而對(duì)照組為491．22+70．05rlli．n3，腫瘤體積差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0．006)。NB4／VEGF-C細(xì)胞癯塊重量為321．78+27．84mg；而對(duì)照組為288．57+40．12mg，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0．031)。免疫組化檢測(cè)NB4NEGF-C細(xì)胞組種植瘤組織切片顯示微

13、血管密度及BCL-2蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組，提示VEGF-C具有誘發(fā)NB4細(xì)胞種植瘤體的血管新生，同時(shí)促進(jìn)NB4細(xì)胞增殖、上調(diào)抗凋亡蛋白BC。 5．VEGF-C及其受體在慢性粒細(xì)胞白血病患者中的表達(dá)差異及臨床意義。 多種血液惡性疾病骨髓的血管密度增加并且與治療疾病進(jìn)程及預(yù)后相關(guān)。近來(lái)在幾種白血病細(xì)胞株中已發(fā)現(xiàn)VEGF-C受體基因的表達(dá)，血管新生相關(guān)因子在骨髓血管分布生成和血液疾病疾病過(guò)程中的作用越來(lái)越受到關(guān)注。

14、為此收集30例CML患者(21例慢性期，6例加速期，3例急變期)及正常成人的骨髓，分離單個(gè)核細(xì)胞，抽提RNA后進(jìn)行RT-PCR得到cDNA，PCR擴(kuò)增VEGF-C、VEGFR-2和3基因。5例缺鐵性貧血患者及12例正常成人作為對(duì)照組。結(jié)果顯示在對(duì)照組骨髓單個(gè)核細(xì)胞中皆不表達(dá)這3種基因；在30例CML患者中，10例表達(dá)VEGF-CmRNA，4例表達(dá)VEGFR-2mRNA，9例表達(dá)VEGFR-3mRNA，其中3例同時(shí)表達(dá)VEGF-C和VEG

15、FR-2，另3例同時(shí)表達(dá)VEGF-C和VEGFR-3，1例三種基因均表達(dá)。6例CML加速期患者有4例表達(dá)VEGFR-3，1例表達(dá)VEGFR-2。3例CML急變期患者有2例同時(shí)表達(dá)VEGFR-3和VEGF-C，1例同時(shí)表達(dá)VEGFR-2和VEGF-C。VEGF-C和VEGFR-3與CML臨床分期有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(尸值分別=0．004,0．009)，而VEGFR-2無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0．265)。結(jié)果提示VEGF-C／VEGFR-3可能以旁分泌