大鼠妊娠前后吸入異氟烷、七氟烷對(duì)子代腦發(fā)育的影響及機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　 已有研究發(fā)現(xiàn)全身麻醉藥可引起發(fā)育期中樞神經(jīng)細(xì)胞的損傷同時(shí)伴有神經(jīng)功能的改變,最近研究發(fā)現(xiàn)突觸發(fā)生期給予NMDA受體阻斷劑會(huì)引起未成熟大鼠腦部神經(jīng)元的廣泛的凋亡。研究表明,在腦的生長爆發(fā)期(人妊娠后3月至出生后最初幾年),CNS易受外界刺激干擾,在成年期表現(xiàn)出個(gè)體神經(jīng)精神行為的異常。目前的研究從神經(jīng)行為學(xué)和免疫組織化學(xué)證實(shí)麻醉藥可引起神經(jīng)元及突觸和相應(yīng)受體可塑性變化。這些研究引起了對(duì)目前使用的麻醉藥的潛在危險(xiǎn)的關(guān)注。

2、異氟烷和七氟烷是目前廣泛應(yīng)用于兒科和產(chǎn)科手術(shù)的吸入麻醉藥,均為NMDAR阻斷劑,它們的應(yīng)用是否會(huì)引起上述潛在的危險(xiǎn)?母體妊娠前后吸入異氟烷、七氟烷是否影響嬰幼兒神經(jīng)元生長、分化、成熟等一系列環(huán)節(jié)的某個(gè)(某些)過程,從而產(chǎn)生遠(yuǎn)期可塑性的變化,進(jìn)而影響智力發(fā)育是需深入研究的重要課題。
　　 材料與方法：
　　 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:雌性SD大鼠3月齡,體重250g左右。雄性SD大鼠體重450-500g。由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)

3、驗(yàn)前觀察一周證實(shí)均健康。動(dòng)物在22-23℃環(huán)境中自由活動(dòng),12:12小時(shí)日夜循環(huán),自由進(jìn)食水。仔鼠出生當(dāng)天被定義為出生后0天。
　　 實(shí)驗(yàn)一:雌性SD大鼠隨機(jī)分為五組:對(duì)照組(C組),孕前暴露于異氟烷組(BI組),孕期暴露于異氟烷組(PI組),孕前暴露于七氟烷組(BS組),孕期暴露于七氟烷組(PS組)。C組,PI組,PS組于孕前在22-23℃環(huán)境中自由活動(dòng),12:12小時(shí)日夜循環(huán),自由進(jìn)食水,各組雌鼠分別以雌雄2:1比例與雄鼠合

4、籠過夜。BI,BS組分別于孕前吸入1MAC異氟烷(1.5％)和七氟烷(2.4％)六小時(shí),于100％純氧中復(fù)蘇后,各組雌鼠分別于當(dāng)晚以雌雄2:1比例與雄鼠合籠過夜。各組雌鼠于次日清晨8時(shí)檢查陰道涂片,以涂片查到精子定為孕0天。確定為懷孕的雌鼠單獨(dú)分籠喂養(yǎng)。各實(shí)驗(yàn)組包含至少6只孕鼠,孕鼠孕期的常規(guī)健康情況被監(jiān)測(cè)。孕鼠每胎產(chǎn)仔鼠8-12只,分娩后,體重較低的仔鼠被淘汰,保持每只雌鼠哺育8只仔鼠,仔鼠于生后21天斷奶。PI組和PS組雌鼠在確定妊

5、娠后,于妊娠6、10、14和18天分別吸入1MAC的異氟烷和七氟烷。本實(shí)驗(yàn)所用的出生0天,7天的大鼠相當(dāng)于新生兒期,出生14天與28天的仔鼠相當(dāng)于兒童期和青年期。各組吸入異氟烷或七氟烷的具體過程如下:50×40×40cm密閉麻醉箱,有三個(gè)開口,箱底鋪一層1 cm厚的鈉石灰,箱子前部一開口接螺紋管,另一開口接麻醉氣體分析儀(Datex Ultima,Helsinki,Finland)和電動(dòng)排風(fēng)扇(流量為2L/Min)、后部開口接通大氣塑料

6、管。異、七氟烷與100％純氧一起濕化后被送入箱內(nèi),大鼠保持自主呼吸,氧氣流量為2L/Min。各組均吸入六小時(shí),麻醉箱內(nèi)每次放入大鼠數(shù)量不超過六只。各組于上午9點(diǎn)至12點(diǎn)吸入1.5％異氟烷,2.4％七氟烷3小時(shí),為避免大鼠連續(xù)吸入出現(xiàn)缺氧和二氧化碳潴留現(xiàn)象,大鼠在100％純氧中復(fù)蘇后,于下午14點(diǎn)至17點(diǎn)再吸入1.5％異氟烷,2.4％七氟烷3小時(shí)結(jié)束。當(dāng)箱內(nèi)氣體達(dá)到初始平衡后(異氟烷濃度達(dá)到1.5％,七氟烷濃度達(dá)到2.4％,氧氣濃度達(dá)到9

7、6％以上),雌鼠被放入麻醉箱,雌鼠呼出氣體濃度和麻醉藥濃度被持續(xù)監(jiān)測(cè)。以溫度計(jì)持續(xù)監(jiān)測(cè)肛溫,并保持體溫在37-38℃。麻醉結(jié)束后,停止麻醉給藥,從麻醉箱中取出雌鼠,左心室穿刺取動(dòng)脈血0.3ml做血?dú)夥治?然后使其在100％純氧中復(fù)蘇。在此期間,大鼠未見明顯的呼吸抑制,并且所有鼠復(fù)蘇后均未見明顯的不良反應(yīng)。Caspase-3檢測(cè)各組P0、P7、P14、P28天子代大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。HE染色觀察仔鼠海馬組織病理變化。電鏡觀察海馬超微結(jié)

8、構(gòu)的變化。免疫組化方法檢測(cè)海馬組織GAP-43及nNOS的表達(dá)。以胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒為caspase-3,GAP-43及nNOS表達(dá)陽性結(jié)果。
　　 實(shí)驗(yàn)二:免疫熒光和RT-PCR檢測(cè)C組、BI組、BS組、PI組、PS組P0、P7、P14、P28子代大鼠海馬NMDAR(NR1、NR2A、NR2B)的表達(dá)。
　　 實(shí)驗(yàn)三:western-blot檢測(cè)C組、BI組、BS組、PI組、PS組P0、P7、P14、P28天子代大鼠

9、海馬PKCα、p-JNK、p-ERK1/2、及Fos蛋白的表達(dá)。統(tǒng)計(jì)分析:采用SPSS13.0軟件,所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間差異用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 實(shí)驗(yàn)一:血?dú)夥治鼋Y(jié)果表明,大鼠在麻醉藥吸入期間,PH,PaCO2,PaO2,HCO3-,SO2,均在正常范圍內(nèi),組間比較未見明顯差異。母體孕前暴露于異氟烷或七氟烷的子代大鼠海馬caspase

10、-3的表達(dá)與對(duì)照組相比無明顯差異。母體孕期暴露于異氟烷或七氟烷的P0,P7,P14子代大鼠海馬caspase-3表達(dá)與對(duì)照組相比表達(dá)顯著增強(qiáng)(P＜0.01),PI組較PS組顯著增強(qiáng)(P＜0.01),P28組表達(dá)與對(duì)照組相比未見明顯差異。母體孕前暴露于異氟烷或七氟烷的子代大鼠海馬GAP-43的表達(dá)與對(duì)照組相比無明顯差異。母體孕期暴露于異氟烷或七氟烷的P0,P7,P14子代大鼠海馬中GAP-43表達(dá)與對(duì)照組相比表達(dá)減弱(P＜0.01),PI

11、組較PS組表達(dá)明顯減弱(P＜0.01),P28組表達(dá)與對(duì)照組相比未見明顯差異。母體孕前暴露于異氟烷或七氟烷的子代大鼠海馬中nNOS的表達(dá)與對(duì)照組相比無明顯差異。母體孕期暴露于異氟烷或七氟烷的P0,P7,P14子代大鼠海馬中nNOS表達(dá)與對(duì)照組相比表達(dá)顯著減弱(P＜0.01),PI組較PS組表達(dá)增強(qiáng)(P＜0.05),P28組表達(dá)與對(duì)照組相比未見明顯差異。C組各時(shí)間點(diǎn)海馬結(jié)構(gòu)清晰,細(xì)胞排列規(guī)則,未見明顯病理改變。同時(shí)可見對(duì)照組細(xì)胞核大,染色

12、較淺,核仁清楚,染色質(zhì)呈疏松狀態(tài)。提示對(duì)照組細(xì)胞的功能比試驗(yàn)組更加旺盛。試驗(yàn)組中,PI組較對(duì)照組有較明顯的病理變化,其余各組在HE染色切片中未見明顯的組織病理學(xué)改變?？梢奝I組0天、7、14天皮質(zhì)及海馬細(xì)胞排列紊亂,細(xì)胞形狀不規(guī)則。海馬錐體細(xì)胞數(shù)量減少,細(xì)胞胞質(zhì)濃縮,染色質(zhì)聚集,細(xì)胞體積減小。PI28組與C組相比未見明顯病理改變。電鏡觀察C,BI和BS組電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)未見明顯變化,PI和PS組可見妊娠期吸入麻醉藥各組0天、7

13、天、14天細(xì)胞內(nèi)線粒體嵴減少,缺損,空泡變性粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張,神經(jīng)細(xì)胞核形不規(guī)則,凹陷,胞漿內(nèi)可見凋亡小體,尤以生后七天變化最為明顯,妊娠前吸入麻醉藥各組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)形態(tài)基本接近正常,核型較好,線粒體空泡變性,高爾基體豐富。28天各試驗(yàn)組海馬超微結(jié)構(gòu)形態(tài)基本接近正常。
　　 實(shí)驗(yàn)二:NMDAR1和NMDAR2A免疫熒光結(jié)果提示:PI,PS,0天、7天、14天組中NMDAR1和NMDAR2A的含量均明顯高于C組(P＜0.01),PI

14、組表達(dá)較PS組顯著增高(P＜0.01),而PI,PS28天組與C組相比未見明顯差異。BI,BS各組與C組相比無明顯差異。NMDAR2B免疫熒光結(jié)果提示,PI、PS0天、7天、14天組中NMDAR2B含量均顯著低于C組(P＜0.01),PI組較PS組明顯增高(P＜0.05),而PI,PS28組與C組相比未見明顯差異,BI,BS各組與C組相比無明顯差異。
　　 RT-PCR結(jié)果顯示,母體孕前暴露于異氟烷或七氟烷的子代大鼠海馬中NMD

15、AR1mRNA和NMDAR2AmRNA的表達(dá)與對(duì)照組相比無明顯差異。母體孕期暴露于異氟烷或七氟烷的P0,P7,P14子代大鼠海馬中NMDAR1mRNA和NMDAR2AmRNA表達(dá)與對(duì)照組相比表達(dá)增強(qiáng)(P＜0.05),PI組表達(dá)較PS組增強(qiáng)(P＜0.05),P28組表達(dá)與對(duì)照組相比未見明顯差異。母體孕前暴露于異氟烷或七氟烷的子代大鼠海馬中NMDAR2BmRNA的表達(dá)與對(duì)照組相比無明顯差異。母體孕期暴露于異氟烷或七氟烷的P0,P7,P14子

16、代大鼠海馬中NMDAR2BmRNA表達(dá)與對(duì)照組相比表達(dá)減弱(P＜0.05),PI組表達(dá)較PS組減弱(P＜0.05),P28組表達(dá)與對(duì)照組相比未見明顯差異。
　　 實(shí)驗(yàn)三:Western-blotting檢測(cè)結(jié)果顯示,母體孕前暴露于異氟烷或七氟烷的子代大鼠海馬中PKCα,p-JNK,p-ERK1/2和Fos表達(dá)與對(duì)照組相比無明顯差異。母體孕期暴露于異氟烷或七氟烷的P0,P7,P14子代大鼠海馬中PKCα,p-JNK表達(dá)與對(duì)照組相比

17、表達(dá)顯著增強(qiáng)(P＜0.01),PI組較PS組表達(dá)增多(P＜0.05)至P28天表達(dá)與對(duì)照組相比未見明顯差異。母體孕期暴露于異氟烷或七氟烷的P0,P7,P14子代大鼠海馬中p-ERK1/2和Fos蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比表達(dá)顯著減弱(P＜0.01),PI組較PS組表達(dá)減少(P＜0.05),P28組表達(dá)與對(duì)照組相比未見明顯差異。
　　 結(jié)論：
　　 1.妊娠期特定時(shí)間吸入1MAC異氟烷或七氟烷6小時(shí)可引起子代大鼠腦發(fā)育的短時(shí)間異