異氟烷預(yù)處理促進(jìn)大鼠隨意型皮瓣存活及機(jī)制研究.pdf

1、臨床上常用隨意型皮瓣來(lái)覆蓋各種外傷、潰瘍、先天性畸形和腫瘤切除的創(chuàng)面和重建其結(jié)構(gòu)。但是，由于隨意型皮瓣缺乏知名血管，其存活主要依賴蒂部的血管網(wǎng)十分有限的供血和供氧，因此皮瓣的遠(yuǎn)端部分經(jīng)常出現(xiàn)缺血甚至壞死。若能增加隨意型皮瓣遠(yuǎn)端的缺血耐受能力，減少可能發(fā)生的缺血性壞死，無(wú)疑將具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　及時(shí)形成新生血管，恢復(fù)灌注對(duì)缺血皮瓣組織的存活與否起著至關(guān)重要的作用。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是一種強(qiáng)大的促血管新生因子，它能

2、促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂，增加內(nèi)皮細(xì)胞滲透性和促進(jìn)血管生成，進(jìn)而起到促進(jìn)組織愈合的作用。同樣，血紅素加氧酶-1(HO-1)作為降解血紅素產(chǎn)生一氧化碳、鐵和膽綠素的關(guān)鍵限速酶，也能減少骨骼肌的缺血壞死。但外源性VEGF和HO-1存在半衰期短、容易降解以及安全性等問(wèn)題。如果在皮瓣缺血前即能誘導(dǎo)VEGF和HO-1表達(dá)，促進(jìn)新生血管形成將有助于提高隨意型皮瓣的存活。
　　近年來(lái)，我們和其他的研究小組發(fā)現(xiàn)除了低氧以外，吸入麻醉藥異氟烷的能調(diào)

3、控低氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)的表達(dá)以及靶基因的轉(zhuǎn)錄。而已知VEGF、HO-1都是HIF-1α下游靶基因，且都部分參與了對(duì)皮瓣缺血損傷的保護(hù)效應(yīng)，因此我們推測(cè):吸入麻醉藥異氟烷預(yù)處理可能對(duì)缺血皮瓣組織具有一定的保護(hù)效應(yīng)，并且很可能是通過(guò)HIF-1α系統(tǒng)表達(dá)上調(diào)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
　　本次實(shí)驗(yàn)中，我們將分別從離體和在體實(shí)驗(yàn)全面研究吸入麻醉藥異氟烷預(yù)處理是否能增加超長(zhǎng)寬比隨意型皮瓣的存活，并且通過(guò)基于慢病毒轉(zhuǎn)染的RNAi技術(shù)來(lái)明確HIF

4、-1α在其中的地位。本課題研究共分為以下三個(gè)部分:
　　第一部分大鼠HIF-1α序列的設(shè)計(jì)和siRNA慢病毒載體的構(gòu)建
　　目的:構(gòu)建能有效抑制大鼠皮膚成纖維細(xì)胞HIF-1α基因表達(dá)的RNAi慢病毒載體(Lentivirus-HIF-1α-siRNA)，為后期研究HIF-1α蛋白在異氟烷預(yù)處理對(duì)缺血皮瓣保護(hù)作用中的地位奠定基礎(chǔ)。
　　方法:設(shè)計(jì)針對(duì)大鼠HIF-1α基因的RNAi序列，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建能有效抑制大鼠HIF-

5、1α基因表達(dá)的lentivirus-HIF-1α-siRNA。轉(zhuǎn)染大鼠皮膚成纖維細(xì)胞后通過(guò)qRT-PCR和westernblot進(jìn)行鑒定。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建了HIF-1α-siRNA質(zhì)粒并進(jìn)行了慢病毒包裝，得到了滴度為109TU/ml的lentivirus-HIF-1α-siRNA。最后經(jīng)qRT-PCR和westemblot進(jìn)行鑒定證實(shí)lentivirus-HIF-1α-siRNA對(duì)HIF-1α基因的干擾效率為85％。
　

6、　結(jié)論:構(gòu)建HIF-1α靶向siRNA重組表達(dá)載體能有效抑制大鼠皮膚成纖維細(xì)胞HIF-1α基因的表達(dá)，因此可用于后續(xù)研究。
　　第二部分異氟烷誘導(dǎo)HUVECs和人皮膚成纖維細(xì)胞HIF-1α表達(dá)上調(diào)及機(jī)制研究
　　目的:以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(HUVECs)和人皮膚成纖維細(xì)胞株為研究對(duì)象，探討吸入麻醉藥異氟烷預(yù)處理是否能誘導(dǎo)HIF-1α及其下游靶基因的表達(dá)，并深入分析可能的信號(hào)機(jī)制。
　　方法:qRT-PCR、ELISA和

7、westernblot檢測(cè)不同濃度異氟烷預(yù)處理或異氟烷處理后不同時(shí)間點(diǎn)HIF-1α、VEGF和HO-1表達(dá)情況。westernblot檢測(cè)異氟烷和缺氧對(duì)細(xì)胞HIF-1α表達(dá)的影響。通過(guò)加入CHX阻斷蛋白質(zhì)合成檢測(cè)HIF-1α蛋白半衰期，并以TGF-1β、DMOG和常氧為陽(yáng)性或陰性對(duì)照，明確異氟烷對(duì)HIF-1α蛋白穩(wěn)定性的影響。通過(guò)給予PI3K抑制劑、GSK3β抑制劑和mTOR抑制劑，來(lái)深入分析可能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　　結(jié)果:異氟烷

8、預(yù)處理HUVECs和人皮膚成纖維細(xì)胞可誘導(dǎo)HIF-1α及其下游靶基因VEGF和HO-1蛋白的表達(dá)。異氟烷預(yù)處理HUVECs能在一定程度上增加HIF-1α蛋白的穩(wěn)定性。PI3K/Akt-mTOR和PI3K/Akt-GSK3β信號(hào)通路共同參與了異氟烷預(yù)處理誘導(dǎo)HUVECs表達(dá)HIF-1α的過(guò)程。
　　結(jié)論:異氟烷預(yù)處理通過(guò)PI3K/Akt-mTOR和PI3K/Akt-GSK3β信號(hào)通路增加了HIF-1α蛋白的表達(dá)和穩(wěn)定。
　　第

9、三部分異氟烷預(yù)處理促進(jìn)超長(zhǎng)寬比隨意型皮瓣存活的在體研究
　　目的:通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)明確異氟烷預(yù)處理是否能增加超長(zhǎng)寬比隨意皮瓣的存活，并且運(yùn)用lentivirus-HIF-1α-siRNA來(lái)明確HIF-1α在其中的地位。
　　方法:取雄性SD大鼠40只，隨機(jī)分為CON、ISO、Neg-siR、HIF-siR和DMOG組(n=8)。CON組:僅接受標(biāo)準(zhǔn)的超長(zhǎng)寬比隨意型皮瓣手術(shù)（陰性對(duì)照）;ISO、Neg-siR和HIF-siR組:

10、在1.5％異氟烷預(yù)處理前48h分別予背部局部注射PBS、scrambledsiRNA和HIF-1αsiRNA。1.5％異氟烷預(yù)處理后24h再接受標(biāo)準(zhǔn)的超長(zhǎng)寬比隨意型皮瓣手術(shù);DMOG組:在術(shù)前48h、術(shù)中和術(shù)后24h分別腹腔注射DMOG（陽(yáng)性對(duì)照）。在術(shù)后7天行皮瓣存活率檢測(cè)和全景激光灌注成像檢測(cè)(FLPI)。術(shù)后第十天行皮瓣組織學(xué)檢測(cè)。
　　結(jié)果:局部注射lentivirus-HIF-1α-siRNA能有效抑制HIF-1α及下游