異氟烷預處理促進大鼠隨意型皮瓣存活及機制研究.pdf

1、臨床上常用隨意型皮瓣來覆蓋各種外傷、潰瘍、先天性畸形和腫瘤切除的創(chuàng)面和重建其結構。但是，由于隨意型皮瓣缺乏知名血管，其存活主要依賴蒂部的血管網十分有限的供血和供氧，因此皮瓣的遠端部分經常出現(xiàn)缺血甚至壞死。若能增加隨意型皮瓣遠端的缺血耐受能力，減少可能發(fā)生的缺血性壞死，無疑將具有重要的臨床應用價值。
　　及時形成新生血管，恢復灌注對缺血皮瓣組織的存活與否起著至關重要的作用。血管內皮生長因子(VEGF)是一種強大的促血管新生因子，它能

2、促進血管內皮細胞有絲分裂，增加內皮細胞滲透性和促進血管生成，進而起到促進組織愈合的作用。同樣，血紅素加氧酶-1(HO-1)作為降解血紅素產生一氧化碳、鐵和膽綠素的關鍵限速酶，也能減少骨骼肌的缺血壞死。但外源性VEGF和HO-1存在半衰期短、容易降解以及安全性等問題。如果在皮瓣缺血前即能誘導VEGF和HO-1表達，促進新生血管形成將有助于提高隨意型皮瓣的存活。
　　近年來，我們和其他的研究小組發(fā)現(xiàn)除了低氧以外，吸入麻醉藥異氟烷的能調

3、控低氧誘導因子-1α(HIF-1α)的表達以及靶基因的轉錄。而已知VEGF、HO-1都是HIF-1α下游靶基因，且都部分參與了對皮瓣缺血損傷的保護效應，因此我們推測:吸入麻醉藥異氟烷預處理可能對缺血皮瓣組織具有一定的保護效應，并且很可能是通過HIF-1α系統(tǒng)表達上調來實現(xiàn)的。
　　本次實驗中，我們將分別從離體和在體實驗全面研究吸入麻醉藥異氟烷預處理是否能增加超長寬比隨意型皮瓣的存活，并且通過基于慢病毒轉染的RNAi技術來明確HIF

4、-1α在其中的地位。本課題研究共分為以下三個部分:
　　第一部分大鼠HIF-1α序列的設計和siRNA慢病毒載體的構建
　　目的:構建能有效抑制大鼠皮膚成纖維細胞HIF-1α基因表達的RNAi慢病毒載體(Lentivirus-HIF-1α-siRNA)，為后期研究HIF-1α蛋白在異氟烷預處理對缺血皮瓣保護作用中的地位奠定基礎。
　　方法:設計針對大鼠HIF-1α基因的RNAi序列，在此基礎上構建能有效抑制大鼠HIF-

5、1α基因表達的lentivirus-HIF-1α-siRNA。轉染大鼠皮膚成纖維細胞后通過qRT-PCR和westernblot進行鑒定。
　　結果:成功構建了HIF-1α-siRNA質粒并進行了慢病毒包裝，得到了滴度為109TU/ml的lentivirus-HIF-1α-siRNA。最后經qRT-PCR和westemblot進行鑒定證實lentivirus-HIF-1α-siRNA對HIF-1α基因的干擾效率為85％。
　

6、　結論:構建HIF-1α靶向siRNA重組表達載體能有效抑制大鼠皮膚成纖維細胞HIF-1α基因的表達，因此可用于后續(xù)研究。
　　第二部分異氟烷誘導HUVECs和人皮膚成纖維細胞HIF-1α表達上調及機制研究
　　目的:以人臍靜脈內皮細胞株(HUVECs)和人皮膚成纖維細胞株為研究對象，探討吸入麻醉藥異氟烷預處理是否能誘導HIF-1α及其下游靶基因的表達，并深入分析可能的信號機制。
　　方法:qRT-PCR、ELISA和

7、westernblot檢測不同濃度異氟烷預處理或異氟烷處理后不同時間點HIF-1α、VEGF和HO-1表達情況。westernblot檢測異氟烷和缺氧對細胞HIF-1α表達的影響。通過加入CHX阻斷蛋白質合成檢測HIF-1α蛋白半衰期，并以TGF-1β、DMOG和常氧為陽性或陰性對照，明確異氟烷對HIF-1α蛋白穩(wěn)定性的影響。通過給予PI3K抑制劑、GSK3β抑制劑和mTOR抑制劑，來深入分析可能的信號轉導機制。
　　結果:異氟烷

8、預處理HUVECs和人皮膚成纖維細胞可誘導HIF-1α及其下游靶基因VEGF和HO-1蛋白的表達。異氟烷預處理HUVECs能在一定程度上增加HIF-1α蛋白的穩(wěn)定性。PI3K/Akt-mTOR和PI3K/Akt-GSK3β信號通路共同參與了異氟烷預處理誘導HUVECs表達HIF-1α的過程。
　　結論:異氟烷預處理通過PI3K/Akt-mTOR和PI3K/Akt-GSK3β信號通路增加了HIF-1α蛋白的表達和穩(wěn)定。
　　第

9、三部分異氟烷預處理促進超長寬比隨意型皮瓣存活的在體研究
　　目的:通過動物實驗來明確異氟烷預處理是否能增加超長寬比隨意皮瓣的存活，并且運用lentivirus-HIF-1α-siRNA來明確HIF-1α在其中的地位。
　　方法:取雄性SD大鼠40只，隨機分為CON、ISO、Neg-siR、HIF-siR和DMOG組(n=8)。CON組:僅接受標準的超長寬比隨意型皮瓣手術（陰性對照）;ISO、Neg-siR和HIF-siR組:

10、在1.5％異氟烷預處理前48h分別予背部局部注射PBS、scrambledsiRNA和HIF-1αsiRNA。1.5％異氟烷預處理后24h再接受標準的超長寬比隨意型皮瓣手術;DMOG組:在術前48h、術中和術后24h分別腹腔注射DMOG（陽性對照）。在術后7天行皮瓣存活率檢測和全景激光灌注成像檢測(FLPI)。術后第十天行皮瓣組織學檢測。
　　結果:局部注射lentivirus-HIF-1α-siRNA能有效抑制HIF-1α及下游