2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
已閱讀1頁,還剩102頁未讀, 繼續(xù)免費(fèi)閱讀

下載本文檔

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進(jìn)行舉報或認(rèn)領(lǐng)

文檔簡介

1、研究背景:
  機(jī)械通氣是重要的生命支持手段也會導(dǎo)致并發(fā)癥急性肺損傷,即機(jī)械通氣所致肺損傷(ventilator-induced lung,VILI),加重免疫系統(tǒng)功能的紊亂,影響呼吸窘迫綜合征等重癥患者預(yù)后。但機(jī)械通氣致肺損傷作用機(jī)制有待探討。因此,開展VILI機(jī)制研究,對探尋防治VILI的措施、改善患者預(yù)后具有重要意義。
  研究表明固有免疫在機(jī)械通氣所致肺損傷過程中發(fā)揮重要作用,明確機(jī)械通氣引發(fā)的免疫效應(yīng)及其分子機(jī)制對

2、于VILI的預(yù)防和治療至為關(guān)鍵。機(jī)械牽張誘發(fā)細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)的釋放,最終導(dǎo)致彌漫性肺泡的損害,病理特征包括滲透性的肺水腫、透明膜的形成以及炎性細(xì)胞的浸潤、促炎因子釋放等。
  肺泡巨噬細(xì)胞(AMs)是重要的靶細(xì)胞,肺泡巨噬細(xì)胞消減可以明顯改善機(jī)械通氣所致肺損傷。肺泡巨噬細(xì)胞大約占肺泡腔外周細(xì)胞數(shù)的5%左右,機(jī)械通氣可以快速激活A(yù)Ms并可能在VILI發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用,其中包含促炎細(xì)胞因子白介素-1β(interleukin-

3、1β,IL-1β)和IL-18釋放,IL-1β受體拮抗劑和抗IL-1β抗體都可以減輕患者急性肺損傷炎性反應(yīng)。促炎細(xì)胞因子IL-1β和IL-18是機(jī)械通氣肺損傷肺部炎癥的明確標(biāo)記。
  IL-1β和IL-18產(chǎn)生與炎性體的激活有密切關(guān)聯(lián)。炎性體(Inflammasome)是由多種蛋白質(zhì)組成的復(fù)合體,可以調(diào)節(jié)固有免疫系統(tǒng)應(yīng)激反應(yīng)。主要的炎性體有:NLRP1、NLRP3、NLRC4、IPAF、AIM2炎性體等。其中NLRP3炎性體可感知

4、傷害性刺激信號而被激活,傷害性刺激包括組織損傷、代謝、應(yīng)激、感染等,現(xiàn)在已知其參與了多種無菌性炎性疾病進(jìn)程。NLRP3炎性體復(fù)合體被激活后進(jìn)一步激活半胱氨酸蛋白酶Caspase-1,后者的成熟體通過蛋白水解作用切割加工促炎細(xì)胞因子pro-IL-1β和pro-IL-18成熟并促進(jìn)它們分泌。然而,機(jī)械力被細(xì)胞感受以及被轉(zhuǎn)化為生物化學(xué)信號并傳導(dǎo)入細(xì)胞的機(jī)制、機(jī)械通氣導(dǎo)致IL-1β和IL-18釋放機(jī)制尚不明確,本文首次探討了NLRP3炎性體機(jī)械

5、牽張肺損傷的調(diào)節(jié)作用。
  我們的預(yù)實驗顯示,機(jī)械牽張可以促使線粒體ROS產(chǎn)生。研究表明抑制或清除ROS可明顯抑制NLRP3的激活。最初的假設(shè)是ROS來源于吞噬相關(guān)NADPH氧化酶ROS,但是隨后的研究表明NADPH基因敲除小鼠實驗中,NLRP3炎性體的激活并未受明顯影響。說明ROS可能來源于另一重要途徑:線粒體ROS。其他研究證據(jù)表明:線粒體ROS是NLRP3炎性體激活所需的主要因素,線粒體功能障礙誘發(fā)NLRP3炎性體激活。另外

6、我們發(fā)現(xiàn)VILI伴隨NLRP3炎性體激活。
  機(jī)械牽張是否通過調(diào)節(jié)ROS的產(chǎn)生影響NLRP3炎性體的激活呢?相關(guān)研究未見報道,據(jù)此,我們提出假說:機(jī)械牽張可能激活ROS依賴性NLRP3炎性體/炎性因子通路,最終導(dǎo)致肺損傷。
  研究目的:
  明確機(jī)械通氣對NLRP3炎性體活性的影響,并探討其作用機(jī)制;探討VILI中ROS對NLRP3炎性體活性的影響;明確ROS/NLRP3/炎性因子信號通路對VILI的調(diào)節(jié)作用。

7、r>  研究方法:
  本研究通過肺泡巨噬細(xì)胞、基因敲除小鼠、小鼠VILI模型等研究對象,采用Western Blot、siRNA轉(zhuǎn)染基因下調(diào)、流式細(xì)胞術(shù)、ELISA等手段,多層面探討機(jī)械通氣肺損傷中ROS/NLRP3炎性體/細(xì)胞因子IL-1β通路的調(diào)節(jié)作用,為探尋防治機(jī)械通氣肺損傷對策提供新的理論依據(jù)。
  第一部分機(jī)械牽張激活肺泡巨噬細(xì)胞NLRP3炎性體/IL-1β信號通路
  1.1、肺泡巨噬細(xì)胞分離提取和機(jī)械牽

8、張
  從C57BL/6JSD小鼠支氣管肺泡灌洗液分離收集肺泡巨噬細(xì)胞,將收集的AMs種植在6孔彈性底培養(yǎng)皿內(nèi)(Bio Flex baseplate),培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的MCDB-131培養(yǎng)基(不含抗生素);細(xì)胞種植密度為1.0×105/cm2,培養(yǎng)皿內(nèi)預(yù)鋪0.1%膠原蛋白Ⅳ,置于5%CO2-95%空氣的孵育箱內(nèi)培養(yǎng)(37℃,飽和濕度)。BioFlex培養(yǎng)皿固定在FX-4000T Flexercell細(xì)胞環(huán)形牽張儀(Fle

9、xcell International,McKeesport,PA)25-mmBioFlex承載臺,進(jìn)行牽張模擬機(jī)械通氣,內(nèi)環(huán)境5%CO2-95%空氣(37℃,飽和濕度)。計算機(jī)設(shè)定牽張參數(shù),牽張頻率30cycles/min(0.5Hz),牽張/松弛比率1∶1。培養(yǎng)皿底部牽張度分別設(shè)定為8、15、和20%,分別對應(yīng)機(jī)械通氣肺通氣量為50、64、80%的肺活量,牽張時間設(shè)為4h。不同牽張時間設(shè)定為0(對照)、1、2、4小時,牽張度設(shè)為20

10、%。
  1.2、siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)
  選擇合適siRNA下調(diào)相關(guān)基因表達(dá):NLRP3/AIM2/IPAF。用無血清培養(yǎng)基稀釋siRNA和Dharma FECT轉(zhuǎn)染試劑,室溫孵育5分鐘,混合后室溫孵育20分鐘,加入無抗生素的完全培養(yǎng)基。換成轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基,在37℃孵育24-48小時。設(shè)立轉(zhuǎn)染試劑、陰性、陽性對照。
  1.3、ELISA試劑盒檢測各組細(xì)胞上清pro-IL-1β、pro-IL-18、IL-1β和IL-18含

11、量變化。
  1.4、Western Blot和IP檢測各組NLRP3/ASC/Caspase-1表達(dá)及相互作用、IL-1β和IL-18含量。
  采用RIPA緩沖液裂解細(xì)胞,提純后用BCA法測定蛋白濃度,然后用WB測定NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β和IL-18含量等,最后用ImageJ軟件分析。
  第二部分機(jī)械牽張激活NLRP3炎性體信號通路需要線粒體ROS
  2.1、分離C57BL/6

12、JSD小鼠,gp91phox-/-小鼠AMs,不同組予以ROS抑制劑、激活劑,ROS熒光標(biāo)記試劑預(yù)處理后進(jìn)行機(jī)械牽張實驗。
  2.2、流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞線粒體ROS變化
  避光10μM MitoSOX Red (Invitrogen-Molecular Probes)標(biāo)記實驗細(xì)胞30min,進(jìn)入各組牽張實驗流程,然后胰蛋白酶-EDTA收集細(xì)胞,將各試驗組細(xì)胞轉(zhuǎn)入流式細(xì)胞技術(shù)專用試管,流式細(xì)胞術(shù)檢測線粒體ROS表達(dá),驗

13、證機(jī)械牽張是否通過線粒體ROS激活NLRP3炎性體。
  2.3、Western Blot檢測NLRP3炎性體表達(dá)
  采用RIPA緩沖液裂解細(xì)胞,提純后用BCA法測定蛋白濃度,然后用WB測定NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β和IL-18含量等,最后用ImageJ軟件分析。
  2.4、ELISA試劑盒檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清pro-IL-1β、pro-IL-18、IL-1β和IL-18含量變化。
  第

14、三部分機(jī)械通氣對小鼠肺NLRP3炎性體的激活作用
  3.1、VILI模型建立
  按照文獻(xiàn)報道和預(yù)實驗方案,建立機(jī)械通氣肺損傷肺損傷模型。
  3.2、NLRP3炎性體表達(dá)
  機(jī)械通氣后分別取各組支氣管肺泡灌洗液和肺組織,Western Blot檢測各組細(xì)胞裂解液中TLR4、NLRP3、ASC、Caspase-1以及pro-IL-1β、pro-IL-18、IL-1β和IL-18含量變化。ELISA法檢測各組支

15、氣管肺泡灌洗液中IL-1β和IL-18含量變化。
  3.3、線粒體ROS拮抗劑SS-31預(yù)處理
  實驗小鼠SS-31霧化吸入預(yù)處理24h,機(jī)械通氣后分別取各組支氣管肺泡灌洗液和肺組織,Western Blot檢測各組細(xì)胞裂解液中TLR4、NLRP3、ASC、Caspase-1以及IL-1β和IL-18含量變化。Elisa法檢測各組支氣管肺泡灌洗液中IL-1β和IL-18含量變化。
  結(jié)果:
  第一部分:機(jī)

16、械牽張激活肺泡巨噬細(xì)胞NLRP3炎性體/IL-1β信號通路
  機(jī)械牽張引起肺泡巨噬細(xì)胞促炎因子IL-1β釋放,并隨牽張時間延長、牽張程度增大而增強(qiáng)。CS誘發(fā)小鼠肺泡巨噬細(xì)胞IL-1β釋放具有caspase-1依賴性。Caspase-1抑制劑明顯減少IL-1β含量。機(jī)械牽張激活小鼠肺泡巨噬細(xì)胞NLRP3炎性體/IL-1β信號通路,而非其他炎性體通路。
  第二部分:機(jī)械牽張激活NLRP3炎性體信號通路需要線粒體ROS

17、  機(jī)械牽張誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞線粒體ROS產(chǎn)生。機(jī)械牽張激活A(yù)MsNLRP3炎性體需要線粒體ROS。NADPH氧化酶ROS未參與機(jī)械牽張所致NLRP3炎性體激活。機(jī)械牽張可能通過AMs尿酸釋放致線粒體ROS產(chǎn)生并激活NLRP3炎性體。
  第三部分:機(jī)械通氣激活小鼠肺ROS/NLRP3炎性體/IL-1β通路
  高潮氣量機(jī)械通氣激活小鼠肺NLRP3炎性體。線粒體ROS抑制劑SS-31抑制機(jī)械通氣所致NLRP3炎性體激活,并降低

18、IL-1β和IL-18產(chǎn)生量。通過肺泡巨噬細(xì)胞消減技術(shù)證明VILI中肺泡巨噬細(xì)胞起關(guān)鍵作用。IL-1β受體拮抗劑減輕機(jī)械通氣所致肺損傷炎性反應(yīng)。
  結(jié)論:
  機(jī)械牽張激活肺泡巨噬細(xì)胞線粒體ROS依賴性NLRP3炎性體信號通路并導(dǎo)致炎性因子IL-1β和IL-18釋放,是VILI早期的重要機(jī)制。
  創(chuàng)新點(diǎn)及意義:
  本研究首次發(fā)現(xiàn)機(jī)械牽張通過激活NLRP3炎性體誘導(dǎo)Caspase-1的活化及IL-1β和IL-

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評論

0/150

提交評論