新型血管生長(zhǎng)因子抗體藥物開(kāi)發(fā)及抗腎腫瘤機(jī)制研究.pdf

1、背景： 血管生成對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移起到關(guān)鍵作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子A(VEGF—A)的發(fā)現(xiàn)及對(duì)其在病理性血管生成中作用的研究引導(dǎo)了抗VEGF—A藥物在治療腫瘤和其他疾病抗血管治療中的應(yīng)用。大量研究表明，很多腫瘤中高表達(dá)VEGF—A，并與腫瘤的惡性程度及轉(zhuǎn)移性相關(guān)。腎細(xì)胞癌(RCC)是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤，惡性程度高的腎細(xì)胞癌只有有限的治療方法，而且預(yù)后較差。這主要由于VHL抑癌基因失活在腎細(xì)胞癌中非常常見(jiàn)，從而上調(diào)了VEGF的表

2、達(dá)?？贵w具有高特異性和親和力的靶向結(jié)合能力，是一種用于治療的理想藥物。至今為止，市場(chǎng)上主要的單克隆藥物均為鼠源性的。兔抗體由于其更高的特異性、親和力及可識(shí)別不同的抗原，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于研究和診斷領(lǐng)域。兔抗的這些特性是作為理想的治療性單克隆抗體所必需的。但因?yàn)橥每篂槎嗫寺】贵w以及鼠單抗的較早開(kāi)發(fā)，關(guān)于兔單克隆抗體在治療領(lǐng)域的應(yīng)用尚未有涉及。從轉(zhuǎn)基因兔中分離出的漿細(xì)胞株作為與兔脾細(xì)胞淋巴細(xì)胞融合的滋養(yǎng)細(xì)胞，使兔雜交瘤及兔單克隆抗體成為可能。

3、 方法： 利用改進(jìn)的兔雜交瘤技術(shù)我們制備了一組抗VEGF—A兔單克隆抗體(RabMAbs)。雜交瘤上清用直接ELISA方法和VEGF/VEGFR2配體受體阻斷ELISA方法篩選。陽(yáng)性雜交瘤的輕鏈與重鏈基因經(jīng)克隆及表達(dá)后，重組抗體用于進(jìn)一步特征性分析。抗體結(jié)合VEGF—A的特異性及親合力用ELISA和BIAcore的方法測(cè)定。抑制VEGF誘導(dǎo)的VEGFR2受體磷酸化的作用由Westernblotting和定量磷酸化ELISA

4、方法檢測(cè)。兔單抗的人源化是在對(duì)可變區(qū)的序列及同源性分析的引導(dǎo)下完成的，骨架區(qū)和互補(bǔ)決定區(qū)的非人源的位點(diǎn)均被替換。人源化抗體的體外生物活性通過(guò)抑制786—O細(xì)胞條件培養(yǎng)的HUVEC細(xì)胞生長(zhǎng)來(lái)測(cè)定?？贵w的體內(nèi)抑瘤活性在人腎細(xì)胞癌裸鼠模型中驗(yàn)證。腫瘤標(biāo)本的微血管密度用CD34免疫組織化學(xué)染色并定量。 結(jié)果： 共篩選到15個(gè)與VEGF—A結(jié)合的中和抗體，可以阻斷VEGF-A和受體VEGFR-2的相互作用及KDR/293細(xì)胞中VE

5、GF誘導(dǎo)的受體水平磷酸化。這些抗體特異性和人VEGF—A結(jié)合，并不與其它VEGF亞型交叉，但其中12個(gè)抗體與鼠VEGF有交叉結(jié)合。人源化的抗體保持了其來(lái)源兔單抗的活性，并具有不同與Bevacizumab的抗原結(jié)合表位。細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)中，該抗體可以抑制786—O條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞的增殖。我們?cè)谌四I細(xì)胞癌裸鼠模型中進(jìn)一步驗(yàn)證了其抑制腫瘤生長(zhǎng)的活性，在給予和Bevacizumab相同劑量和給藥方案時(shí)，表現(xiàn)出更好的效果(p＜0.05