立體誘導(dǎo)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化及其SOX9與Ⅱ型膠原基因時空表達關(guān)系的研究.pdf

1、目的：分離培養(yǎng)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BoneMarrow-derivedMesenchymalStemCells，BMSCs)。體外立體誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成軟骨方向分化，觀察立體誘導(dǎo)過程中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中Sox9及Ⅱ型膠原mRNA的含量隨時間的表達關(guān)系，對組織工程化軟骨進行基因水平上的初步研究。
　　 方法：新西蘭大白兔3只。股骨粗隆處備皮，用骨髓穿刺針抽取骨髓，采用全骨髓貼壁培養(yǎng)生長法培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，使之得到分離純化

2、。傳代至第3代備用。MTT法測細(xì)胞增值率，描繪增殖曲線，觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。取3代細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量為1.5×106/離心管，150g離心后分為實驗組（立體成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)組）與對照組（立體非成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)組）。實驗組采用含有10ng/mlthTGF-β1的成軟骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)，對照組采用不含TGF-β1的誘導(dǎo)液進行培養(yǎng)。分別在第4天，8天，12天，16天提取總RNA，行RT-PCR，檢測Sox9及Ⅱ型膠原mRNA表達。
　　 結(jié)果：全

3、骨髓培養(yǎng)后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞呈貼壁生長，隨著換液骨髓中其他不貼壁生長的細(xì)胞逐漸被棄去，使得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞得到進一步純化。傳代后細(xì)胞生長速度明顯加快，并呈旋渦狀生長。3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長良好，經(jīng)歷潛伏期、對數(shù)期、平臺期。實驗組細(xì)胞第2天形成小球，并逐漸長大。而對照組細(xì)胞無法形成小球，松散沉積于離心管底。RT-PCR檢測實驗組Sox9與Ⅱ型膠原表達含量均隨時間逐漸升高，兩者呈高度相關(guān)性。對照組Sox9表達隨時間變化無明顯統(tǒng)計學(xué)意義，Ⅱ型