Sox9基因修飾人臍帶間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞分化的實驗研究.pdf

1、目的：構(gòu)建人Sox9基因慢病毒載體，體外Sox9幔病毒載體轉(zhuǎn)染人臍帶間充質(zhì)干細胞(hUC-MSCs)，觀察Sox9基因轉(zhuǎn)染對hUC-MSCs生物學(xué)特性的影響，以及經(jīng)Sox9基因修飾的hUC-MSCs在單層培養(yǎng)條件下向軟骨細胞分化的能力，為軟骨組織損傷及退變性疾病的細胞學(xué)及基因治療提供實驗依據(jù)。
　　 方法：通過PCR的方法獲得人Sox9基因編碼區(qū)片段，將該片段克隆入慢病毒載體Pwpxl-MOD中產(chǎn)生Pwpxl-MOD/Sox9，

2、通過酶切測序鑒定慢病毒載體，將Pwpxl-MOD/Sox9、pRsv-REV、pMD1g-pRRE、pMD2G共轉(zhuǎn)染293T細胞，包裝成含有Sox9基因的重組慢病毒。采用酶消化法從人臍帶基質(zhì)中獲取間充質(zhì)干細胞，流式細胞儀進行細胞表型鑒定，誘導(dǎo)向成骨、脂肪分化以觀察其多向分化潛能。包裝好的慢病毒體外轉(zhuǎn)染hUC-MSCs，利用熒光倒置相差顯微鏡觀察轉(zhuǎn)基因細胞的形態(tài)變化、綠色熒光表達(GFP)情況，轉(zhuǎn)染后48h確定基因轉(zhuǎn)染效率。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶

3、鏈反應(yīng)(RT-PCR)法及免疫印跡(Western-blot)檢測Sox9在huC-MSCs中的表達；四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)法測定慢病毒對細胞增殖能力的影響。在高密度單層培養(yǎng)條件下，不增加生長因子、地塞米松等軟骨誘導(dǎo)液，將Sox9基因修飾的hUC-MSCs培養(yǎng)分化21d，RT-PCR、Western-blot、免疫組化及免疫熒光染色、阿利新蘭染色檢測特異性軟骨細胞分子標(biāo)志Ⅱ型膠原、Agrrecan的表達以及蛋白多糖的分泌情況。<

4、br>　　 結(jié)果：酶切、測序鑒定證實慢病毒載體Pwpxl-MOD中插人片段為基因Sox9。經(jīng)檢測包裝好的慢病毒滴度為6.0×107TU/ml；從人臍帶基質(zhì)分離出的hUC-MSCs形態(tài)類似于成纖維樣細胞，CD29(95.9％)、CD44(96.5％)表達陽性，CD34(3.O％)、CD45(2.6％)造血干細胞表型標(biāo)志表達為陰性。向脂肪及成骨方向誘導(dǎo)培養(yǎng)21d，油紅O染色、堿性磷酸酶染色、Von kossa染色均為強陽性，表明hUC-M

5、SCs具有較強的多向分化潛能?；蜣D(zhuǎn)染48h后觀察到較強的綠色熒光表達，Lenti-GFP-Sox9及Lenti-GFP的轉(zhuǎn)染率均達到90％以上。RT-PCR、Western-blot檢測到目的基因Sox9在hUC-MSCs中出現(xiàn)過表達(P<0.001)，細胞生長曲線顯示轉(zhuǎn)染對hUC-MSCs的增殖活力無明顯影響(P>0.05)。Sox9基因修飾的hUC-MSCs在單層培養(yǎng)下7d開始出現(xiàn)自發(fā)性的細胞聚集現(xiàn)象，到14d細胞集聚明顯增大，2

6、1d左右，有較大的軟骨結(jié)節(jié)形成。而Lenti-GFP及未轉(zhuǎn)染的細胞無明顯的細胞集聚現(xiàn)象產(chǎn)生。RT-PCR、Western-blot、免疫組化及免疫熒光染色檢測到Ⅱ型膠原、Agrrecan有較高水平的表達，阿利新蘭染色示大量的蛋白多糖的在軟骨結(jié)節(jié)中結(jié)聚。
　　 結(jié)論：1、成功構(gòu)建了含有Sox9基因慢病毒載體。2、人臍帶間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)擴增容易，具有多向分化潛能，易于被外源性基因修飾。2、在單層培養(yǎng)條件下，無生長因子及其他軟骨誘