菜籽多糖的制備、表征及體外活性.pdf

1、菜籽粕是菜籽榨油后的副產(chǎn)物。菜籽多糖的研究與開發(fā)有利于菜籽粕的綜合利用。對于菜籽多糖的結(jié)構(gòu)國外已有一些研究，而對于其功能活性則未見有文獻(xiàn)報道。本文以華雜4號“雙低”菜籽粕為原料，利用傅里葉變換紅外光譜學(xué)(FT-IR)、氣相色譜(GC)、高效液相色譜(HPLC)、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)、核磁共振(NMR)對分離純化得到的菜籽多糖進(jìn)行組成和結(jié)構(gòu)表征，并采用化學(xué)發(fā)光分析評價其體外清除自由基能力，MTT法、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PC

2、R)等細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)方法研究了菜籽多糖對脾淋巴細(xì)胞、腹腔巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.菜籽多糖的制備及表征。菜籽多糖的制備及表征國外已有較多研究。本文重點(diǎn)研究了華雜4號菜籽粕中多糖的提取優(yōu)化條件、綠色環(huán)保的純化工藝以及表征方法。
　　 1.1經(jīng)過前處理的脫脂菜籽粕，按照中心組合實(shí)驗(yàn)(CCD)得到的水溶性多糖提取優(yōu)化工藝條件，即以水按液料比為28:1(mL/g)在94℃浸提2.9 h，一次提

3、取菜籽多糖得率為2.18％，連續(xù)提取三次將水溶性多糖提取殆盡。剩余的殘渣料再以5％NaOH溶液作提取劑，按料液比1:20，60℃提取2 h，得到的提取液以4 M HCl溶液中和至pH=5。得到的水溶性多糖和堿溶性多糖兩部分提取液分別經(jīng)篩選出的特1號大孔吸附樹脂柱層析、分步醇沉、DE-52纖維素離子交換柱層析等方法純化，分別得到各自的主要級分WPS-1和APS-2。WPS-1和APS-2再通過葡聚糖凝膠G-200柱層析和凝膠滲透色譜(GP

4、C)進(jìn)行純度鑒定，結(jié)果表明WPS-1和APS-2都是相對均一多糖。
　　 1.2 WPS-1和APS-2均為白色絮狀的非淀粉多糖；中性糖含量分別為83.2％和66.8％；糖醛酸含量分別為6.1％和9.3％；蛋白質(zhì)含量分別為3.78％和8.65％。WPS-1和APS-2中蛋白質(zhì)部分都由天門冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、酪氨酸、纈氨酸、胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸等9種氨基酸組成。GPC法測定WPS-

5、1和APS-2的重均分子量(Mw)分別為7.20×105和1.61×105，數(shù)均分子量(Mn)分別為2.45×105和6.79×105。FT-IR、GC、HPLC初步分析WPS-1和APS-2的官能團(tuán)特征及單糖組成，確定WPS-1單糖主要由阿拉伯糖(Ara)、半乳糖(Gal)、葡萄糖(Glc)、葡萄糖醛酸(GlcA)組成，其摩爾百分含量分別為66.6％、18.3％、12.6％、2.51％；APS-2單糖組成包括Ara、Gal、Glc、甘

6、露糖(Man)、半乳糖醛酸(GalA)、GlcA、Rha摩爾百分含量分別為52.8％、21.7％、10.6％、5.0％、4.8％、3.6％、1.4％。通過甲基化分析以及一維NMR(包括13C NMR和1H NMR)對WPS-1的結(jié)構(gòu)表征進(jìn)行了研究，結(jié)合前人的相關(guān)研究成果，得出WPS-1的主體部分是主要是由(1→5)鍵和(1→2)鍵連接的Ara殘基組成的多支鏈α-阿拉伯聚糖。
　　 2.菜籽多糖的體外活性。菜籽多糖的生物活性本實(shí)驗(yàn)

7、室曾作初步研究，國內(nèi)外未見有菜籽多糖生物活性的報道。本文重點(diǎn)從細(xì)胞、分子水平上研究了菜籽多糖的生理活性。
　　 2.1分別采用鄰苯三酚-魯米諾、硫酸銅-鄰菲噦啉-抗壞血酸.雙氧水、魯米諾-雙氧水三種化學(xué)發(fā)光體系，通過微弱發(fā)光測量儀測定了WPS-1和APS-2對超氧陰離子(O2·-)、羥基自由基(HO·)和雙氧水(H2O2)三種ROS的體外清除作用。結(jié)果表明WPS-1和APS-2對各ROS都有良好的體外清除作用，且都呈劑量-效果關(guān)

8、系。WPS-1和APS-2在實(shí)驗(yàn)最高濃度2000μg/mL時，對O2·-的極大抑制率分別為90.4％和89.6％。WPS-1和APS-2對O2·-的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為400±44μg/mL和450±64μg/mL。WPS-1比APS-2具有更好的清除O2·-能力。WPS-1和APS-2在實(shí)驗(yàn)最高濃度1000μg/mL時，其對HO·的極大抑制率分別為93.8％和86.7％。WPS-1和APS-2對HO·的IC50分別為240±

9、18μg/mL和293±24μg/mL。WPS-1比APS-2具有更好的清除HO·的能力。WPS-1和APS-2在實(shí)驗(yàn)最高濃度50μg/mL時，其對H2O2的極大抑制率分別為84.2％和85.2％。WPS-1和APS-2對H2O2的IC50分別為10.0±0.8μg/mL和6.1±0.5μg/mL。APS-2清除H2O2的能力略強(qiáng)于WPS-1。比較IC50值，WPS-1和APS-2對各自由基的清除能力都表現(xiàn)為：H2O2>HO·>O2·-

10、。
　　 2.2采用尼龍毛柱法從脾淋巴細(xì)胞分離T、B淋巴細(xì)胞。通過MTT法檢測，菜籽多糖對總脾淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞具有明顯的增殖活性，并表現(xiàn)出明顯的劑量-效果關(guān)系，增殖的最佳濃度為40μg/mL，并且WPS-1比APS-2作用效果更好。采用半定量RT-PCR進(jìn)一步研究菜籽多糖WPS-1對T淋巴細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子白細(xì)胞介素2(IL-2)、IL-4、IL-6、干擾素γ(IFN-γ)mRNA表達(dá)的影響。首先研究了各細(xì)胞因子mRNA隨W

11、PS-1作用時間的變化，WPS-1促進(jìn)IL-2、IL-4、IL-6 mRNA表達(dá)最佳作用時間都為24 h，而促進(jìn)IFN-γ mRNA表達(dá)的最佳作用時間為12 h。采用各細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的最佳作用時間，進(jìn)一步考察WPS-1濃度的影響，得到其對促進(jìn)IL-2、IL-6、IFN-γ mRNA表達(dá)的最佳濃度都為40μg/mL，而對IL-4則為20μg/mL。菜籽多糖可能對淋巴細(xì)胞的免疫功能具有調(diào)節(jié)作用。
　　 2.3采用MTT法檢測細(xì)

12、胞的活性，菜籽多糖能促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖，并表現(xiàn)出明顯的劑量-效果關(guān)系，菜籽多糖促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖的最佳濃度為40μg/mL，WPS-1比APS-2對巨噬細(xì)胞增殖活性的促進(jìn)作用略大。菜籽多糖對巨噬細(xì)胞的影響與對T淋巴細(xì)胞的檢測結(jié)果相類似，。采用半定量RT-PCR進(jìn)一步研究不同作用時間下40μg/mL菜籽多糖WPS-1對腹腔巨噬細(xì)胞IL-6、腫瘤壞死因子α(TNF-α)這兩種細(xì)胞因子以及誘生型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA表達(dá)的影響。WPS-