菜籽多糖的化學(xué)修飾及其衍生物的體外抗氧化和益生活性研究.pdf

1、本研究以菜籽為原料，經(jīng)預(yù)處理、提取、分離和純化得到均一菜籽多糖RPM1-a，采用單糖組成分析、甲基化分析和核磁共振技術(shù)對(duì)其一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，并研究了RPM1-a的流變性質(zhì);對(duì)RPM1-a分別進(jìn)行硫酸化修飾、乙?；揎椇汪燃谆揎?，評(píng)價(jià)了RPM1-a及其修飾產(chǎn)物的體外抗氧化活性以及對(duì)腸道益生菌體外增殖活性的影響。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:
　　1.菜籽多糖的提取、分離和純化。菜籽經(jīng)過脫殼、粉碎、去油脂、除色素等預(yù)處理后，用氫氧化鈉溶

2、液浸提，然后通過脫蛋白、濃縮、醇沉、離心、冷凍干燥得到菜籽粗多糖。分別以去離子水和0.10 mol/L NaCl溶液為洗脫液，將粗多糖通過DEAE-Bestarose柱層析分離，收集由去離子水洗脫的組分，經(jīng)過透析和冷凍干燥后，再用Chromdex-200層析柱進(jìn)一步純化，最后得到多糖組分RPM1-a。
　　2.菜籽多糖一級(jí)結(jié)構(gòu)的解析。紅外光譜分析表明，RPM1-a具有多糖的特征吸收峰，為多糖類物質(zhì);高效液相色譜分析表明，RPM1-

3、a為相對(duì)均一的多糖組分，相對(duì)分子量約為15.96 kDa。由氣相色譜分析的結(jié)果可知，RPM1-a由鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖組成，各單糖的摩爾比為3.70∶47.00∶21.30∶27.90。綜合甲基化分析和核磁共振波譜分析的結(jié)果可以推斷，RPM1-a的主鏈由→6)-β-Galp-(1→、→3，4)-α-Rhap-(1→和→4)-α-Glcp-（1→構(gòu)成，其O-3、O-4位被支鏈取代;主要支鏈和次要支鏈分別由β-Araf-(1→(

4、5-β-Araf-1)16→(3-β-Araf-1)13→3)-β-Galp-(1→和β-Galp-(1→4)-β-Galp-(1→構(gòu)成。其中，主要支鏈取代在O-3位，次要支鏈取代在O-4位。
　　3.菜籽多糖的流變性質(zhì)。采用流變儀研究了外界條件的改變對(duì)菜籽多糖黏度的影響。結(jié)果顯示，菜籽多糖RPM1-a溶液黏度隨其濃度的增加而增大，隨溫度和剪切速率的增大而減小;濃度對(duì)溶液黏度的影響較顯著，穩(wěn)態(tài)剪切條件下高濃度RPM1-a溶液(10

5、％，m:v)為典型的假塑性非牛頓流體。pH對(duì)RPM1-a溶液的黏度影響較顯著，在pH5～9，溶液黏度隨pH增大而增大;但當(dāng)pH大于9時(shí)，溶液黏度呈降低趨勢(shì)。Ca2+對(duì)RPM1-a黏度的變化的影響較為顯著，且隨著Ca2+濃度的增大，溶液黏度呈上升趨勢(shì)。
　　4.菜籽多糖的化學(xué)修飾。菜籽多糖RPM1-a經(jīng)硫酸化、乙?；汪燃谆揎棧謩e得到相應(yīng)產(chǎn)物:SRPM1-a、AcRPM1-a和CRPM1-a。紅外光譜分析顯示，SRPM1-a在

6、1250 cm-1附近有不對(duì)稱S=O鍵伸縮振動(dòng)引起的吸收峰，830cm-1左右有C-O-S拉伸振動(dòng)引起的吸收峰，588 cm-1附近有硫酸根基團(tuán)O-S-O的對(duì)稱變形引起的吸收峰;AcRPM1-a1735 cm-1附近的吸收峰由-COCR中的C=O不對(duì)稱伸縮振動(dòng)引起，1373 cm-1左右有H-C=O引起的吸收峰，1247 cm-1附近有C-O引起的吸收峰;CRPM1-a1635 cm-1處吸收峰消失，而在1596、1421和1324 c

7、m-1處出現(xiàn)由C=O、C-O和COO-引起的吸收峰。以上結(jié)果表明，硫酸化、乙?；汪燃谆揎棾晒?。
　　5.構(gòu)建超氧陰離子自由基、羥基自由基、DPPH·自由基和Fe2+誘發(fā)的油脂過氧化等抗氧化體系，探索硫酸化修飾產(chǎn)物(SRPM1-a)、乙?；揎棶a(chǎn)物(AcRPM1-a)和羧甲基化修飾產(chǎn)物(CRPM1-a)的抗氧化性，并與未經(jīng)修飾的菜籽多糖(RPM1-a)的抗氧化性進(jìn)行比較。結(jié)果表明，RPM1-a經(jīng)硫酸化修飾后，體外抗氧化活性得到

8、一定的增強(qiáng);硫酸化產(chǎn)物SRPM1-a對(duì)超氧陰離子自由基和DPPH·自由基的清除作用，以及Fe2+誘發(fā)的油脂過氧化抑制作用均優(yōu)于其他三種多糖。在乙?；汪燃谆揎棶a(chǎn)物中，體外抗氧化活性未見顯著增強(qiáng);乙酰化產(chǎn)物的抗氧化活性低于未經(jīng)修飾的菜籽多糖。這說明化學(xué)基團(tuán)的引入可能會(huì)改變多糖的抗氧化活性，但不同的化學(xué)基團(tuán)產(chǎn)生的影響有所不同。
　　6.菜籽多糖化學(xué)修飾前后對(duì)腸道益生菌的體外增殖作用研究。通過體外培養(yǎng)的方法，以培養(yǎng)基的OD值和pH值

9、為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究了菜籽多糖RPM1-a及其化學(xué)修飾產(chǎn)物SRPM1-a、AcRPM1-a和CRPM1-a對(duì)嗜酸乳桿菌、嬰兒雙歧桿菌、青春雙歧桿菌和兩歧雙歧桿菌的增殖作用。結(jié)果表明，菜籽多糖RPM1-a及其修飾產(chǎn)物SRPM1-a、AcRPM1-a和CRPM1-a對(duì)四種菌株均有一定的增殖促進(jìn)作用，其中，SRPM1-a較RPM1-a的增殖效果更為明顯。四種多糖對(duì)益生菌增殖作用的最佳濃度為1.5％～2.0％;超過此范圍，益生菌數(shù)量不再增加，或呈下

10、降趨勢(shì)。在體外培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基的pH值隨益生菌數(shù)目的增加而相應(yīng)降低，說明RPM1-a、SRPM1-a、AcRPM1-a和CRPM1-a均可被益生菌利用，產(chǎn)生有機(jī)酸類物質(zhì)。其中，添加SRPM1-a和AcRPM1-a的培養(yǎng)基pH降低更加明顯。益生菌生長速率的研究表明，益生菌在添加菜籽多糖RPM1-a的培養(yǎng)基中培養(yǎng)32 h達(dá)到穩(wěn)定期，而在添加SRPM1-a和AcRPM1-a的培養(yǎng)基中24 h即可達(dá)到穩(wěn)定期。菜籽多糖RPM1-a的硫酸化和乙酰