RNAi沉默4-1BB基因表達(dá)抗大鼠肝移植急性排斥反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： （1）構(gòu)建針對大鼠T淋巴細(xì)胞4—1BB基因編碼區(qū)的小發(fā)夾RNA（shRNA）表達(dá)質(zhì)粒和慢病毒載體系統(tǒng)，觀察RNA（RNAi）對大鼠T淋巴細(xì)胞共刺激分子4—1BB基因表達(dá)和功能的影響。 （2）探討阻斷T淋巴細(xì)胞4—1BB/4—1BBL共刺激通路在大鼠肝移植急性排斥反應(yīng)中的作用。 方法： （1）根據(jù)RNAi作用原理，設(shè)計(jì)、合成4條T淋巴細(xì)胞4—1BB基因的shRNA（shRNA441、shRNA540

2、、 shRNA621、shRNA758），插入質(zhì)粒pGPU6，構(gòu)建4個編碼目的shRNA的表達(dá)質(zhì)粒（p441、p540、p621、p758），酶切及測序鑒定。設(shè)對照組，利用電穿孔法在體外將目的基因片段導(dǎo)入BN大鼠T淋巴細(xì)胞，48小時后，半定量逆轉(zhuǎn)錄·聚合酶鏈反應(yīng)（RT—PCR）和流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測其對T細(xì)胞4—1BB基因表達(dá)的抑制作用，并篩選、確定最佳效果的干擾質(zhì)粒。 （2）利用篩選出的質(zhì)粒，PCR擴(kuò)增其中的U6+shRN

3、A序列，克隆至慢病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pcDNA—CMV—Lentivector并經(jīng)酶切和測序鑒定，與包裝質(zhì)粒以脂質(zhì)體介導(dǎo)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，產(chǎn)生shRNA重組慢病毒。病毒顆粒感染BN大鼠T淋巴細(xì)胞6～8h后，與經(jīng)絲裂霉素處理的Lewis大鼠淋巴細(xì)胞作單項(xiàng)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)，設(shè)對照組和干擾組。RT—PCR、FCM、Western bloting方法檢測4—1BB表達(dá)，MTT、3H—TdR檢測干擾后T細(xì)胞的增殖能力，F(xiàn)CM測定凋亡細(xì)胞數(shù)，ELISA法

4、檢測細(xì)胞因子IL—2、IL—10、IFN—γ水平。 （3）“二袖套法”行Lewis鼠到Brown Norway（BN）鼠原位肝移植24例，大鼠隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)對照組、陰性對照組和干涉實(shí)驗(yàn)組，每組8對。三組的受體鼠分別在移植前12 h經(jīng)陰莖背靜脈注射1ml生理鹽水、空病毒和重組病毒液。于術(shù)后第5天每組處死BN鼠3只，取脾臟，RT—PCR、FCM檢測在體T細(xì)胞4—1BB表達(dá)；取下腔靜脈血檢測細(xì)胞因子和生化指標(biāo)；取肝組織觀察病理變化；剩余

5、大鼠觀察術(shù)后生存情況。 結(jié)果： （1）經(jīng)酶切反應(yīng)及測序證實(shí)構(gòu)建成功重組干擾質(zhì)粒p441、p540、p621和p758，轉(zhuǎn)染T細(xì)胞后，4—1BB相對表達(dá)量分別為（33.4±2.3）%、（53.0±2.3）%、（62.1±3.1）%、（40.9±1.5）%，對照組4—1BB相對表達(dá)量為（67.2±1.5）%。其中p441沉默效果最佳（p<0.01）。 （2）經(jīng)酶切反應(yīng)及測序證實(shí)，重組慢病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pLVs441序列正

6、確，包裝產(chǎn)生病毒液（LVs441）滴度在5×106TU/ml，濃縮后約3×108TU/ml。LVs441感染T細(xì)胞效率約90%，干涉組4—1BB表達(dá)量顯著下降（p<0.01）；T細(xì)胞凋亡較明顯（p<0.05）；T細(xì)胞增殖能力、IL—2，IFN—γ水平低于實(shí)驗(yàn)對照組。 （3）干涉組BN鼠脾淋巴細(xì)胞4—1BB表達(dá)量低于對照組（p<0.05）；兩組IL—10、T—BIL水平無明顯差別，但干涉組IL—2、IFN—γ和ALT、 AST、L

7、DH水平均低于對照組（p<0.05）；對照組和干涉組大鼠肝組織急性排斥Banff評分分別為7.11±0.78、5.89±1.05（p=0.0384）、平均生存時間分別為10.4±1.95天和29±14.78天（p<0.05）。 結(jié)論： （1）siRNA可特異性抑制大鼠T淋巴細(xì)胞共刺激分子4—1BB基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，誘發(fā)T細(xì)胞凋亡，抑制大鼠T細(xì)胞的增殖能力，降低IL—2，IFN—γ等細(xì)胞因子的分泌水平。 （2）RNA