脂肪間充質干細胞PD-L1基因沉默對大鼠肝移植急性排斥反應的影響.pdf

1、目的：構建PD-L1基因RNA 干擾慢病毒表達載體，穩(wěn)定轉染脂肪間充質干細胞（ADSCs）實現(xiàn)PD-L1基因沉默；研究肝移植術前輸注PD-L1基因沉默ADSCs 對大鼠肝移植急性排斥反應的影響及機制。
　　 方法：設計針對PD-L1的shRNA 序列,應用基因重組技術插入到pFU-GW-iRNA 慢病毒表達載體，重組病毒質粒及其3 種輔助包裝原件載體質粒通過共轉染293T細胞，包裝產(chǎn)生的病毒感染ADSCs；利用兩套管吻合技術行S

2、D 大鼠對Wistar 大鼠異種原位肝移植模型，將受體Wistar 大鼠隨機分為4組，每組10只：對照組（A組），供體組（B組），第三方組（C組），第三方轉染組（D組），行肝移植前7天，對照組輸注1ml PBS，實驗組分別輸注1ml 含有1×107個供體SD 大鼠ADSCs、第三方SD 大鼠ADSCs和第三方SD 大鼠PD-L1基因RNA 干擾ADSCs的PBS。術后7天處死大鼠，觀察各組肝功能情況，IL-2和IL-10水平，肝臟病理變

3、化，TUNEL 檢測細胞凋亡，Western blot 檢測Bcl-2和Bax 蛋白的表達。
　　 結果：通過測序證實PD-L1 干擾序列正確插入pFU-GW-iRNA 載體,成功構建PD-L1基因RNAi 慢病毒表達載體，病毒滴度為5×108TU/ml，在轉染后48h，即可在熒光顯微鏡下見明亮的綠色熒光，最佳感染復數(shù)（MOI）為20；與A組相比，其它各組大鼠術后血清谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、總膽紅素和白介素2水平明顯降低（P<0

4、.05），D組高于C組；白介素10 明顯升高（P<0.05），D組低于C組；HE 染色顯示，A組大鼠肝組織呈急性重度排斥反應，B組、C組大鼠肝組織呈急性輕度排斥反應，D組大鼠肝組織呈急性中度排斥反應；TUNEL 染色顯示A組大鼠的肝臟組織切片上凋亡細胞大量存在，而B組和C組相對較少，D組可見較多凋亡細胞。Western blot 結果顯示：A組Bcl-2 蛋白低表達，B組和C組表達較高，D組表達低于C組；A組Bax蛋白高表達，B組和C組