RNAi沉默TGF-β1對(duì)抗大鼠移植腎纖維化機(jī)制的研究.pdf

1、第一部分：
　　 目的：建立大鼠移植腎纖維化加快模型并轉(zhuǎn)染,觀察shRNA-TGF-β1質(zhì)粒(轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1干擾質(zhì)粒)對(duì)大鼠移植腎炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維化的影響。
　　 方法：采用強(qiáng)化供腎冷缺血的方法,建立SD大鼠為供體,Wistar大鼠為受體的移植腎纖維化加快模型,將受體分為四組:T組為質(zhì)粒組,受者注射RNAi質(zhì)粒；H組為空質(zhì)粒組,受者注射空質(zhì)粒；Y組為移植組,受者僅行腎移植,不注射任何質(zhì)粒；J組為假手術(shù)組,只打開腹腔切

2、除左腎,不進(jìn)行腎移植。并利用流體力學(xué)為基礎(chǔ)的腎臟基因轉(zhuǎn)染技術(shù)進(jìn)行相應(yīng)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染。HE染色評(píng)估各組移植腎炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維化程度。
　　 結(jié)果：成功建立大鼠移植腎纖維化加快模型,移植組腎大鼠較短時(shí)間腎臟即纖維化縮??；HE染色示移植腎間質(zhì)大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),細(xì)胞外充滿大量的嗜伊紅色細(xì)胞外基質(zhì),纖維化程度較重；相反質(zhì)粒組的大鼠移植腎炎性細(xì)胞細(xì)胞浸潤(rùn)少,纖維化程度較輕。
　　 結(jié)論：強(qiáng)化冷缺血能加快移植腎纖維化；以流體力學(xué)為基礎(chǔ)的

3、腎臟基因轉(zhuǎn)染技術(shù)具有可行性；shRNA-TGF-β1質(zhì)?？蓽p輕移植腎炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維化。
　　 第二部分：
　　 目的:觀察shRNA-TGF-β1質(zhì)粒對(duì)大鼠移植腎TGF-β1及ECM(細(xì)胞外基質(zhì))表達(dá)的影響。
　　 方法:移植術(shù)后1、2、3個(gè)月時(shí)收集腎臟標(biāo)本；RT-PCR及Westernblot檢測(cè)TGF-β1,Masson染色觀察移植腎細(xì)胞外基質(zhì)的沉積。
　　 結(jié)果:質(zhì)粒組TGF-β1表達(dá)受到抑制,

4、明顯低于移植組及空質(zhì)粒組(P<0.01 or P<0.05);質(zhì)粒組移植腎細(xì)胞外基質(zhì)沉積少于移植組及空質(zhì)粒組。
　　 結(jié)論:shRNA-TGF-β1質(zhì)粒能抑制移植腎TGF-β1的表達(dá),減少細(xì)胞外基質(zhì)的生成,一定程度上預(yù)防移植腎纖維化。
　　 第三部分：
　　 目的:探討shRNA-TGF-β1質(zhì)粒對(duì)抗大鼠移植腎纖維化作用機(jī)制。
　　 方法:RT-PCR及Western blot檢測(cè)各組移植腎p-Smad3

5、(磷酸化-Smad3)、p-Smad7(磷酸化-Smad7)、E-cadherin、Ⅰ型膠原的mRNA及蛋白表達(dá)；E-cadherin及α肌動(dòng)蛋白(α-SMA)免疫組化染色分別標(biāo)記腎小管上皮細(xì)胞及成纖維母細(xì)胞,觀察移植腎上皮細(xì)胞及成纖維母細(xì)胞變化的情況。
　　 結(jié)果:質(zhì)粒組p-Smad3表達(dá)受到抑制,低于移植組及空質(zhì)粒組(P<0.01 or P<0.05)；質(zhì)粒組p-Smad7表達(dá)上調(diào),高于移植組及空質(zhì)粒組(P<0.01 orP

6、<0.05)；質(zhì)粒組Ⅰ型膠原表達(dá)受到抑制,明顯低于移植組及空質(zhì)粒組(P<0.01 or P<0.05)；質(zhì)粒組E-cadherin表達(dá)高于H、Y組(P<0.01 or P<0.05)；質(zhì)粒組E-cadherin標(biāo)記的腎小管上皮細(xì)胞多于對(duì)照組,α-SMA標(biāo)記的成纖維母細(xì)胞少于對(duì)照組,發(fā)生上皮一間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的細(xì)胞較少。
　　 結(jié)論:shRNA-TGF-β1質(zhì)粒對(duì)抗移植腎纖維化的機(jī)制可能是下調(diào)信號(hào)蛋白p-Smad3的表達(dá)、上調(diào)p-Sma