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文檔簡(jiǎn)介
1、[研究背景及目的]
小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的固有免疫細(xì)胞,其在維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)微環(huán)境的動(dòng)態(tài)平衡中扮演重要角色。近年來(lái),研究認(rèn)為神經(jīng)元-小膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)失衡與神經(jīng)元損傷及中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病密切相關(guān)。其中,小膠質(zhì)細(xì)胞活化后介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)和氧化損傷已成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究熱點(diǎn)之一。目前,越來(lái)越多的研究證實(shí)活化的小膠質(zhì)細(xì)胞可促進(jìn)一氧化氮(nitricoxide,NO)、腫瘤壞死因子-α(tumornecrosis
2、factor-α,TNF-α)等炎癥因子的釋放。然而,小膠質(zhì)細(xì)胞活化的調(diào)控及其介導(dǎo)神經(jīng)炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制十分復(fù)雜,尚待進(jìn)一步研究闡明。
蛋白酶激活受體2(protease-activatedreceptor2,PAR2)是與G蛋白相偶聯(lián)的受體,屬于蛋白酶激活受體(protease-activatedreceptors,PARs)家族成員之一,主要被胰蛋白酶和類胰蛋白酶等激活,其獨(dú)特的激活方式及廣泛的病理生理作用,使其有望作
3、為重要的藥物干預(yù)靶點(diǎn)而受到越來(lái)越多關(guān)注。近年來(lái),研究發(fā)現(xiàn)PAR2廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng),在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷和退行性疾病等病理過(guò)程中扮演重要角色。目前,研究人員普遍認(rèn)為在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中PAR2的激活可表現(xiàn)出“保護(hù)”和“損害”的雙重作用,并推測(cè)其可能與細(xì)胞類型及疾病所處的病理階段不同等因素相關(guān),但具體作用機(jī)制仍不明確。最近研究發(fā)現(xiàn),胰蛋白酶可激活星形膠質(zhì)細(xì)胞表面PAR2,通過(guò)MAPK-NF-κB通路促進(jìn)NO的合成與釋放。目前,針對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞
4、PAR2激活介導(dǎo)神經(jīng)炎癥反應(yīng)的研究還十分有限。我們前期研究中發(fā)現(xiàn),活化的肥大細(xì)胞可釋放類胰蛋白酶激活小膠質(zhì)細(xì)胞表面PAR2,引起小膠質(zhì)細(xì)胞活化,小膠質(zhì)細(xì)胞活化后同樣通過(guò)MAPK通路促進(jìn)BDNF的合成與釋放。因此,我們推測(cè)外源性添加類胰蛋白酶可激活小膠質(zhì)細(xì)胞表面PAR2,進(jìn)而促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞合成和釋放NO、TNF-α等炎癥因子,介導(dǎo)神經(jīng)炎癥反應(yīng),導(dǎo)致周圍神經(jīng)元損傷。
綜上所述,鑒于小膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫炎癥反應(yīng)中的重要作
5、用,本課題通過(guò)體外原代細(xì)胞培養(yǎng)等技術(shù),研究類胰蛋白酶激活小膠質(zhì)細(xì)胞PAR2后不同時(shí)間點(diǎn)NO、TNF-α、IL-1β等炎癥因子的釋放情況,并觀察其對(duì)體外培養(yǎng)神經(jīng)元存活的影響,旨在探索PAR2在小膠質(zhì)細(xì)胞活化及其介導(dǎo)神經(jīng)炎癥反應(yīng)中的作用,也期望為開(kāi)發(fā)更有效的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷防治新策略提供作用靶點(diǎn),具有理論和臨床意義。
[研究方法]
1.類胰蛋白酶干預(yù)小膠質(zhì)細(xì)胞,檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)上清液中BDNF、IL-1β、TN
6、F-α及NO的含量。
體外分離純化培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)原代小膠質(zhì)細(xì)胞,添加類胰蛋白酶(Tryptase)20U/ml,隨后分別在第0,0.5,1,2,12,24和72h收集小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液(microgliaconditioningmedium,MCM),通過(guò)ELISA法檢測(cè)上清液中BDNF、IL-1β及TNF-α含量,Griess法測(cè)定上清液中NO2-含量作為衡量NO水平的指標(biāo)。
2.利用PAR2特異性激動(dòng)劑、
7、抑制劑及RNA干擾技術(shù),探索PAR2在類胰蛋白酶激活小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)炎癥反應(yīng)中的作用。
體外分離純化培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)分4組。對(duì)照組;實(shí)驗(yàn)組一:體外培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞+SLIGRL-NH2(PAR2特異性激動(dòng)劑);實(shí)驗(yàn)組二:體外培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞+FSSRY-NH2(PAR2特異性抑制劑)+Trypmse;實(shí)驗(yàn)組三:體外培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞+PAR2shRNA+Tryptase,24h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液,Griess法測(cè)定比較
8、不同組別NO水平。
3.類胰蛋白酶激活小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)體外培養(yǎng)神經(jīng)元存活的影響。
體外分離培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元,實(shí)驗(yàn)分3組。對(duì)照組:體外培養(yǎng)神經(jīng)元+未經(jīng)類胰蛋白酶處理的MCM;早期組:體外培養(yǎng)神經(jīng)元+類胰蛋白酶處理后第1h收集MCM;晚期組:體外培養(yǎng)神經(jīng)元+第72h收集的MCM,再培養(yǎng)神經(jīng)元48h,隨后通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)和TUNEL染色檢測(cè)神經(jīng)元凋亡情況。
4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
數(shù)據(jù)使用SPSS
9、13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,結(jié)果以X±SD表示。多組間比較采用單因素方差分析(one-wayANOVA),p≤0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[研究結(jié)果]
1.類胰蛋白酶干預(yù)早期BDNF釋放短暫性升高,晚期TNF-α等炎癥因子含量逐漸增加
檢測(cè)結(jié)果顯示,類胰蛋白酶激活小膠質(zhì)細(xì)胞后早期MCM中BDNF含量迅速增加,在1h釋放達(dá)到高峰,但72h內(nèi)逐漸下降至起始水平;與之相反,IL-1β、TNF-α及
10、NO的含量則隨時(shí)間推移逐漸升高,在最后一次測(cè)量時(shí)間點(diǎn)(72h)仍保持較高水平。
2.類胰蛋白酶通過(guò)激活小膠質(zhì)細(xì)胞PAR2介導(dǎo)炎癥反應(yīng)
PAR2特異性激動(dòng)劑SLIGRL-NH2顯著增加小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO的含量,與對(duì)照組相比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(11.24±1.09VS2.25±0.26,p<0.05);用PAR2抑制劑和慢病毒預(yù)處理小膠質(zhì)細(xì)胞后,再用類胰蛋白酶干預(yù)小膠質(zhì)細(xì)胞,培養(yǎng)上清液中NO的含量與對(duì)照
11、組相比,無(wú)明顯差異(2.53±0.40VS2.25±0.26,p>0.05;2.25±0.27VS2.25±0.26,p>0.05),表明類胰蛋白酶是通過(guò)激活PAR2介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞NO的釋放。
3.類胰蛋白酶干預(yù)晚期的MCM促進(jìn)體外培養(yǎng)神經(jīng)元凋亡
流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果:晚期組神經(jīng)元凋亡率明顯增加,與對(duì)照組和早期組相比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(13.60%±1.51%VS3.33%±0.51%,p<0.05;13.6
12、0%±1.51%VS3.27%±0.42%,p<0.05);而早期組和對(duì)照組相比較,神經(jīng)元凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(3.33%±0.51%VS3.27%±0.42%,p>0.05)。TUNEL染色結(jié)果:晚期組免疫熒光強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯高于對(duì)照組和早期組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(17.67%±0.45%VS5.57%±1.35%,p<0.05;17.67%±0.45%VS6.67%±0.47%,p<0.05)。
[研究結(jié)論]
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