NLRP3炎癥體介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)在錳神經(jīng)毒性中的作用.pdf

1、背景：
　　錳是人體所必須的微量元素。參與人體免疫反應(yīng)，ATP的生成，骨骼生長(zhǎng)等生理反應(yīng)。此外，錳還可以作為機(jī)體許多酶的輔助因子，保障其發(fā)揮正常的生理作用。然而，當(dāng)機(jī)體攝入過多的錳則會(huì)引起錳中毒的發(fā)生，其臨床表現(xiàn)主要為類似帕金森氏病病癥。中樞神經(jīng)系統(tǒng)是錳作用人體的主要靶器官，黑質(zhì)紋狀體通路更是錳損傷神經(jīng)系統(tǒng)的關(guān)鍵核團(tuán)。形成了錳能夠引起黑質(zhì)紋狀體內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元功能減弱的經(jīng)典理論。隨著人們對(duì)錳神經(jīng)毒性的進(jìn)一步關(guān)注，錳對(duì)海馬腦區(qū)調(diào)控的

2、空間記憶能力損傷也漸漸被人們所證實(shí)。研究證實(shí)錳在大腦中的蓄積所造成的神經(jīng)毒性作用與阿爾茲海默癥（Alzheimer’s disease，AD）、帕金森癥（Parkinson's disease，PD）、等多種神經(jīng)退行性疾病都有著密切的關(guān)系。
　　在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，小膠質(zhì)細(xì)胞是免疫反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞，主要來源于腦膜，脈絡(luò)叢以及血管周圍。其與巨噬細(xì)胞的功能相似，能通過一系列的模式識(shí)別受體（Pattern-Recognition Recep

3、tors, PRR）實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的內(nèi)環(huán)境。當(dāng)組織受損或有害物質(zhì)入侵的情況下，小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生活化反應(yīng)，一方面發(fā)揮吞噬作用，一方面釋放大量炎癥因子，誘導(dǎo)外周固有免疫細(xì)胞及適應(yīng)性免疫細(xì)胞遷移至受損或入侵部位，發(fā)揮免疫防御作用。因此，小膠質(zhì)細(xì)胞活化及炎性因子釋放在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫應(yīng)答防御反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用。小膠質(zhì)細(xì)胞活化后能夠快速誘導(dǎo)出多種炎性因子，其中包括白介素-1β（Interleukin-1 beta，IL-1β）、腫瘤壞死因

4、子-α（Tumor Necrosis Factor-alpha，TNF-α）和IL-18等。本課題組以往研究發(fā)現(xiàn)，錳暴露能夠誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化，活化后釋放的炎性因子可能是錳暴露導(dǎo)致神經(jīng)元損傷的關(guān)鍵因素，研究結(jié)果為錳神經(jīng)毒性機(jī)制闡明及錳中毒防護(hù)提供了重要線索。
　　炎癥體是近年來炎性疾病領(lǐng)域關(guān)注的重點(diǎn)，在炎性因子成熟、釋放過程中發(fā)揮重要作用。NLRP3炎癥體是調(diào)控IL-1β、IL-18等炎性因子成熟釋放的重要途徑。在神經(jīng)炎癥中，小膠

5、質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞內(nèi)的NLRP3炎癥體能被β淀粉樣蛋白（Amyloid-beta，Aβ），α-共核蛋白（α-synuclein，α-syn）所激活?；罨腘LRP3發(fā)生寡聚化，募集接頭蛋白ASC，通多CARD結(jié)構(gòu)域與PYD結(jié)構(gòu)域相互作用，進(jìn)一步激活caspase-1，進(jìn)而加工pro-IL-1β為成熟的IL-1β，并釋放于細(xì)胞外發(fā)揮作用。
　　調(diào)控NLRP3炎癥體活化成熟的因素很多，細(xì)胞內(nèi)ROS的增多、K+濃度改變、ATP水平降低以及

6、自噬等均能夠影響NLRP3炎癥體的活化。自噬是細(xì)胞維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定重要的生理過程。自噬的形成過程包括自噬的啟動(dòng)、延伸、與溶酶體的融合和降解幾個(gè)重要階段。當(dāng)自噬形成的某一過程受到抑制時(shí)則會(huì)導(dǎo)致自噬功能處于紊亂狀態(tài)。研究表明，許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生都與自噬功能的異常相關(guān)，PD、AD等均發(fā)現(xiàn)體內(nèi)自噬降解過程異常。自噬與NLRP3炎癥體之間的關(guān)系較為復(fù)雜，一方面當(dāng)NLRP3炎癥體處于激活狀態(tài)時(shí)，則會(huì)促進(jìn)自噬的發(fā)生；另一方面，自噬的過度活化則能夠抑

7、制 NLRP3炎癥體的活化。許多研究表明，自噬的抑制能夠活化 NLRP3炎癥體，促進(jìn)pro-IL-1β（36kDa）向成熟IL-1β轉(zhuǎn)變。雖然自噬能夠調(diào)控NLRP3炎癥體的活化，但其具體機(jī)制至今尚未闡明，這也成為當(dāng)今該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。
　　目的：
　　研究錳暴露誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化及其釋放的炎性因子在錳介導(dǎo)的學(xué)習(xí)記憶損傷中的作用；揭示NLRP3炎癥體活化是錳誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化釋放炎性因子IL-1β和IL-18的關(guān)鍵環(huán)節(jié)

8、；闡明自噬溶酶體功能紊亂與NLRP3炎癥體活化之間的關(guān)系；揭示錳暴露誘導(dǎo)的自噬功能紊亂調(diào)控NLRP3炎癥體活化的具體機(jī)制，為錳神經(jīng)毒性的防護(hù)和治療提供關(guān)鍵靶點(diǎn)和理論依據(jù)。
　　方法：
　　1．通過皮下注射氯化錳的方法，構(gòu)建錳暴露的小鼠體內(nèi)模型，采用原子熒光光譜法檢測(cè)小鼠血錳和腦錳的濃度，運(yùn)用恐懼條件箱以及電生理實(shí)驗(yàn)評(píng)估小鼠錳暴露后學(xué)習(xí)和記憶能力的改變；
　　2．通過免疫熒光化學(xué)法檢測(cè)錳暴露后NLRP3炎癥體在小鼠海馬區(qū)

9、以及BV2細(xì)胞（之后簡(jiǎn)稱為BV2）中的表達(dá)改變。Western blot檢測(cè)NLRP3炎癥體相關(guān)蛋白NLRP3、cleaved caspase-1，炎性因子IL-1β的表達(dá)改變；
　　3．通過ELISA檢測(cè)錳暴露后炎性因子IL-1β、IL-18和TNF-α的改變，以及qRT-PCR檢測(cè)NLRP3和炎性因子IL-1β、IL-18mRNA水平的改變。
　　4．通過免疫熒光化學(xué)法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3的表達(dá)影響，Western b

10、lot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白Beclin1、Atg5、LC3、p62、組織蛋白酶B（cathepsin B）蛋白的變化。透射電鏡觀察BV2自噬亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的改變；，
　　5．分別運(yùn)用Atg5 siRNA、Baf A1以及NH4Cl處理BV2，Western blot檢測(cè)錳暴露后NLRP3炎癥體相關(guān)蛋白NLRP3、cleaved caspase-1，炎性因子IL-1β的表達(dá)改變，ELISA檢測(cè)錳暴露后炎性因子IL-1β、IL-18的改變。<

11、br>　　結(jié)果：
　　1．皮下注射氯化錳7天后，小鼠血錳和腦錳與對(duì)照組相比明顯升高，恐懼條件箱檢測(cè)以及LTP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)錳暴露后能夠引起小鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降；
　　2．海馬腦片以及BV2免疫熒光化學(xué)染色表明，錳暴露能夠引起NLRP3炎癥體表達(dá)增多。Western blot結(jié)果顯示，體內(nèi)外錳暴露均能夠引起NLRP3炎癥體相關(guān)蛋白NLRP3、cleaved caspase-1表達(dá)的增加；
　　3．ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)錳暴露能

12、夠誘導(dǎo)炎性因子IL-1β、IL-18表達(dá)增加，并且在mRNA水平檢測(cè)上也得以證實(shí)；
　　4．免疫細(xì)胞化學(xué)熒光染色結(jié)果提示，錳暴露可導(dǎo)致BV2內(nèi)LC3標(biāo)記的自噬體大量聚集。Western blot發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，錳暴露后自噬體相關(guān)蛋白Beclin1、Atg5、LC3II、p62、組織蛋白酶Bbiao’da表達(dá)顯著增加。p62升高提示錳暴露能夠引起自噬溶酶體降解功能出現(xiàn)障礙。組織蛋白酶 B的表達(dá)增加以及電鏡檢測(cè)所發(fā)現(xiàn)的溶酶體形態(tài)異常

13、提示錳暴露能夠引起B(yǎng)V2溶酶體功能異常。
　　5．Atg5 siRNA和Baf A1分別抑制自噬體的啟動(dòng)、延伸和與溶酶體的融合后，并不能抑制錳暴露所誘導(dǎo)的NLRP3炎癥體的活化及IL-1β、IL-18的釋放。NH4Cl作用BV2后，Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其能夠降低組織蛋白酶B的表達(dá)，抑制錳暴露所誘導(dǎo)的NLRP3炎癥體的活化以及炎性因子IL-1β、IL-18的釋放。
　　結(jié)論：
　　1．體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)錳能夠降低海

14、馬腦區(qū)所調(diào)控的學(xué)習(xí)和記憶能力。
　　2．錳暴露對(duì)學(xué)習(xí)記憶能力的影響可能與其所誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化后釋放的促炎性因子（IL-1β和IL-18等）有關(guān)。
　　3．錳暴露激活NLRP3炎癥體通路是其介導(dǎo)炎性因子釋放的關(guān)鍵因素。
　　4．自噬溶酶體功能紊亂參與了錳誘導(dǎo)的NLRP3炎癥體活化，自噬體啟動(dòng)、延伸及與溶酶體融合的異常不是調(diào)控NLRP3炎癥體活化的重要環(huán)節(jié).
　　5．錳暴露導(dǎo)致的溶酶體功能異常及cathepsin