破骨細(xì)胞功能相關(guān)分子CTSK與ClC-7的臨床及基礎(chǔ)研究.pdf

1、骨改建是維持骨骼質(zhì)量、強(qiáng)度以及鈣鹽平衡必不可少的過程，是破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收過程和成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成過程協(xié)同作用的結(jié)果。一旦破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞之間的平衡被打破將會(huì)導(dǎo)致骨形態(tài)和結(jié)構(gòu)的異常，從而引發(fā)一系列骨代謝性疾病。近年來隨著細(xì)胞生物學(xué)及分子遺傳學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，破骨細(xì)胞在遺傳性骨病中的作用逐漸被揭開。有研究表明：電壓門控氯離子通道7（voltage-gatedchloridechannel7gene，CLCN7）及組織蛋白酶K（cath

2、epsinK，CTSK）等十余個(gè)基因異常均可引起破骨細(xì)胞功能障礙，進(jìn)而導(dǎo)致遺傳性骨硬化性疾病。本研究選擇了3例CTSK或CLCN7基因突變所致的遺傳性骨病患者進(jìn)行相關(guān)的臨床和基礎(chǔ)研究，旨在探討破骨細(xì)胞功能相關(guān)分子CTSK與ClC-7參與疾病發(fā)生的機(jī)理，為相關(guān)疾病的診斷、預(yù)防及治療提供理論依據(jù)。
　　CTSK基因突變所致致密性成骨不全的臨床和基礎(chǔ)研究
　　作為破骨細(xì)胞重要的功能分子，CTSK主要參與降解骨有機(jī)基質(zhì)，并可以通過調(diào)

3、控破骨細(xì)胞凋亡控制破骨細(xì)胞數(shù)量。CTSK基因突變將導(dǎo)致一類罕見的常染色體隱性遺傳性疾病——致密性成骨不全。本研究對1996年以來文獻(xiàn)報(bào)道的109個(gè)家系中的159例致密性成骨不全患者進(jìn)行了回顧性研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：①其中59個(gè)家系（涉及104例患者）的基因分析發(fā)現(xiàn)了33種不同的CTSK基因突變類型，主要以錯(cuò)義突變?yōu)橹鳎?9.70％），且位于6號(hào)外顯子的Arg241和位于7號(hào)外顯子的Ala277是突變的高發(fā)位點(diǎn)；59個(gè)家系中除了1個(gè)單親二倍體家

4、系外，攜帶純合子突變的家系共44個(gè)（74.58％），攜帶復(fù)合雜合子突變的家系為14個(gè)（23.73％）。②根據(jù)74個(gè)家系中97例致密性成骨不全患者的臨床表征，本研究發(fā)現(xiàn)身材矮小、骨密度增高、顱縫不閉合、顱骨膨隆、頻發(fā)骨折、下頜角變鈍、頜骨發(fā)育不良、四肢短小伴指/趾端溶骨是該病最常見的八大表征。③除了錯(cuò)義突變患者指/趾端溶骨和下頜角變鈍陽性率較高外（P<0.05），其余基因型與表型之間沒有明確的關(guān)系。根據(jù)回顧性研究的結(jié)果，我們首次創(chuàng)建了CT

5、SK基因突變數(shù)據(jù)庫（http://www.centralmutations.org/Lsdb.php＃CTSK）。
　　為了進(jìn)一步研究CTSK功能，探討CTSK參與疾病發(fā)生的機(jī)理，本部分研究選擇了我科接診的一例致密性成骨不全患者，在全面檢查、基因分析和家系研究的基礎(chǔ)上不但證實(shí)了該患者的診斷（該患者30年來一直被診斷為骨硬化癥），還發(fā)現(xiàn)了一對新的CTSK雜合突變位點(diǎn)（p.Trp29X和p.Tyr283Cys）、2個(gè)父系p.Tyr28

6、3Cys攜帶者和7個(gè)母系p.Trp29X攜帶者。同時(shí)提出顱頜面部特征在致密性成骨不全的鑒別診斷中具有重要意義。
　　對該患者接受死骨清除術(shù)時(shí)一并去除的左側(cè)上頜磨牙進(jìn)行MicroCT掃描和組織學(xué)觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：牙根周圍牙骨質(zhì)明顯增厚（平均厚度為1.30±0.42mm），牙骨質(zhì)與周圍牙槽骨之間沒有明確的界限，根管狹窄伴部分鈣化閉鎖，但牙本質(zhì)無明顯異常。從而提出CTSK除了在骨代謝方面發(fā)揮重要作用外，很可能參與牙骨質(zhì)的形成并發(fā)揮重要作用

7、。同時(shí)提出了致密性成骨不全患者拔牙后繼發(fā)頜骨骨髓炎的一個(gè)可能機(jī)制：增厚的牙骨質(zhì)與周圍牙槽骨之間沒有明確的界限，使得拔牙時(shí)容易損傷患牙周圍的牙槽骨，增大拔牙創(chuàng)面，造成更多的牙槽骨暴露，從而導(dǎo)致拔牙后繼發(fā)頜骨骨髓炎的風(fēng)險(xiǎn)增大。
　　免疫功能相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)該患者外周血總IgE和抑制性T淋巴細(xì)胞升高、IL-17A水平和輔助性T淋巴細(xì)胞降低。利用白芍總甙膠囊和胸腺肽腸溶膠囊進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)治療12周后，各項(xiàng)異常的免疫指標(biāo)均有不同程度的改善，且右側(cè)

8、上頜骨骨髓炎相關(guān)的臨床癥狀逐漸緩解，口內(nèi)病灶區(qū)新生肉芽組織形成并逐漸增大，部分覆蓋拔牙創(chuàng)底。該患者外周血IL-17A水平降低不僅預(yù)示著CTSK可能在人免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，同時(shí)也揭示了致密性成骨不全患者拔牙后繼發(fā)頜骨骨髓炎的又一可能機(jī)制：輔助性T淋巴細(xì)胞17及其相關(guān)細(xì)胞因子的匱乏導(dǎo)致致密性成骨不全患者抵抗外源微生物感染的能力減低，從而增加拔牙后頜骨骨髓炎發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。
　　CLCN7基因突變所致骨硬化癥的臨床和基礎(chǔ)研究
　　

9、ClC-7作為一種Cl-/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)體位于破骨細(xì)胞的褶皺緣上，通過控制氯離子通透性，調(diào)控骨吸收陷窩內(nèi)的pH值。CLCN7基因突變將導(dǎo)致一組遺傳性疾病——骨硬化癥，根據(jù)其遺傳方式、臨床特征、疾病的發(fā)病年齡以及嚴(yán)重程度，可以分為三型：常染色體隱性遺傳性骨硬化癥（autosomalrecessiveosteopetrosis，ARO）、常染色體顯性遺傳性骨硬化癥Ⅱ型（autosomaldominantosteopetrosistypeⅡ，A

10、DOⅡ）、中間型常染色體隱性遺傳性骨硬化癥（intermediateautosomalrecessiveosteopetrosis，IARO）。本部分研究選擇2例不同類型的CLCN7基因突變導(dǎo)致的骨硬化癥患者進(jìn)行了相關(guān)的臨床和基礎(chǔ)研究。
　　通過詳細(xì)的臨床研究和CLCN7基因測序分析，證實(shí)了病例2為中國首例IARO患者，并發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的CLCN7純合突變位點(diǎn)p.Pro470Leu，其母為該位點(diǎn)的雜合攜帶者。同時(shí)發(fā)現(xiàn)該患者表現(xiàn)有睪丸

11、及陰莖發(fā)育障礙，染色體核型分析發(fā)現(xiàn)其Y染色體增大（Yq+）。在以往的研究中，并未見骨硬化癥患者表現(xiàn)有生殖系統(tǒng)發(fā)育障礙的報(bào)道。但CLCN7基因突變、Yq+和男性外生殖器發(fā)育障礙之間是否存在相關(guān)性還有待于進(jìn)一步研究。
　　CLCN7基因測序分析，明確了病例3為CLCN7基因雜合突變（p.Arg286Trp）導(dǎo)致的ADOⅡ。外周血免疫球蛋白、IL-17水平及淋巴細(xì)胞亞型分析發(fā)現(xiàn)該患者外周血輔助性T淋巴細(xì)胞輕度降低，余未見明顯異常。ClC

12、-7在人免疫系統(tǒng)中的作用還有待于進(jìn)一步研究。
　　本部分研究還發(fā)現(xiàn)病例2、3均表現(xiàn)有部分后牙埋藏伴不同程度的牙根發(fā)育障礙，于是首次提出ClC-7可能參與牙根發(fā)育，且其在牙根發(fā)育中的作用存在時(shí)空效應(yīng)和劑量效應(yīng)的假設(shè)。
　　結(jié)論
　　本研究通過對159例致密性成骨不全患者的文獻(xiàn)回顧性研究，得出了致密性成骨不全的臨床及分子遺傳學(xué)特征，并首次創(chuàng)建了CTSK基因突變數(shù)據(jù)庫。通過對3例CTSK或CLCN7基因突變所致的遺傳性骨病患