白細胞介素34調控成骨細胞表達破骨細胞分化相關因子及作用機制.pdf

1、目的：
　　正畸治療的關鍵在于牙槽骨的改建，在這個過程中，成熟的破骨細胞(osteoclast，OC)是行使骨吸收功能的重要細胞，而OC的分化及成熟主要受成骨細胞（osteoblast，OB）的調控。在多種理化因素，如機械力、細胞因子、化學因子等的作用下，OB可以表達多種OC分化相關因子，如PGE2(prostaglandinE2)'RANKL(receptor activator ofNF-κB ligand,RANKL), M

2、-CSF(macrophagecolony-stimulatingfactor,M-CSF), OPG(osteoprotegrin, OPG), IL（interleukin，IL）-1，IL-6和TNF-α稱為OC分化相關因子，其中尤以RANKL和M-CSF最為關鍵。RANKL可以和OC上的相應受體-RANKL(receptor activatorof nuclear factor kappa B，RANK)結合，促進OC分化、活化

3、。此外，OB還分泌OPG，做為“餌受體”高度特異性與RANK結合，抑制RANKL的作用，抑制OC分化，促進OC凋亡。因此，RANKL-RANK-OPG系統(tǒng)被認為是近年發(fā)現(xiàn)的調節(jié)骨吸收的一個關鍵信號通路。
　　IL-34是近年來新發(fā)現(xiàn)的細胞因子，其與多種炎癥疾病及骨丟失疾病相關，體外研究表明IL-34可促進外周血單核細胞向OC分化。IL-34可促進入外周血細胞分泌炎性細胞因子，如IL-6、IL-17及化學趨化因子等。作為最新發(fā)現(xiàn)的骨

4、吸收炎性因子，IL-34參與骨性疾病的發(fā)病過程中，如類風濕關節(jié)炎和骨關節(jié)炎等。研究發(fā)現(xiàn)IL-34與M-CSF共用同一受體CSF1R(colony stimulating factor-1receptor，CSF1R)，可以聯(lián)合RANKL促進OC的分化及成熟。IL-34在骨吸收過程中的重要作用正不斷被發(fā)現(xiàn)，OB是調控OC分化的重要細胞，而關于IL-34與OB之間的相互作用尚未見報道。
　　在正畸牙移動過程中，齦溝液內PGE2的表達水

5、平較高。PGE2可促進OC分化和骨吸收，并調節(jié)炎癥反應，是骨重建過程中一個重要因素。IL-17作為一種促炎因子可以通過調控PGE2影響OB表達OC分泌相關因子，而在類風濕關節(jié)炎發(fā)病過程中，IL-34與IL-17關系密切，因此我們假設IL-34可能通過IL-17調控OB和OC分化及功能，參與牙槽骨的代謝。
　　本研究通過檢測IL-17、IL-34對OB增殖能力、表達OC分化因子的影響，探討IL-34在調控骨代謝過程的作用，為進一步揭

6、示牙槽骨改建及正畸牙移動的具體分子機制提供理論及實驗依據。
　　方法：
　　選擇新生小鼠顱骨細胞系MC3T3-E1作為實驗對象，細胞按2.0×104cells/cm2密度接種于96孔板，用含10％FBS的α-MEM培養(yǎng)。用含50mM磷酸甘油和50μM/ml抗壞血酸的培養(yǎng)液培養(yǎng)20天，采用固定液（4％甲醛磷酸鹽緩沖液）固定15分鐘，沖洗:采用飽和的茜紅素染色10分鐘，PBS沖洗15分鐘，染色鮮紅的部位即代表鈣化結節(jié)。
　

7、　以2.0×104cells/cm2的密度將MC3T3-E1細胞接種于100mm的培養(yǎng)皿，待細胞融合80％，換用含1％FBS的α-MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)12h后，分別進行以下實驗。
　　一、加入不同濃度IL-17(0、0.1、1、10ng/mL)，刺激0h、24h、48h、72h后，CCK法檢測細胞增殖，流式細胞PI染色檢測細胞周期，RT-PCR檢測RANKL、OPG mRNA表達，ELISA法檢測RANKL、OPG和PGE2蛋白表達。

8、
　　二、加入不同濃度IL-34(0、10、50、100ng/mL)，刺激0h、24h、48h、72h后，CCK法檢測細胞增殖，流式細胞PI染色檢測細胞周期，RT-PCR檢測RANKL、OPG mRNA表達，ELISA法檢測RANKL、OPG和PGE2蛋白表達。
　　三、加入IL-17（10ng/mL）和IL-34(100ng/mL)刺激0、24h、48h、72h后，CCK法檢測細胞增殖，流式細胞PI染色檢測細胞周期，RT-

9、PCR檢測RANKL、OPG mRNA表達，ELISA法檢測RANKL、OPG和PGE2蛋白表達。
　　結果：
　　一、MC3T3-E1細胞體外培養(yǎng)經骨向誘導劑刺激可以形成鈣結節(jié)。
　　二、IL-17、IL-34顯著抑制MC3T3-E1細胞增殖能力，并顯著增加MC3T3-E1細胞G0/G1期比例，減少G2/M期比例。IL-17、IL-34聯(lián)合作用時，效果最為顯著。
　　三、IL-17、IL-34顯著促進MC3T3

10、-E1細胞在mRNA和蛋白水平RANKL的表達，顯著抑制mRNA和蛋白水平上OPG的表達。IL-17、IL-34聯(lián)合作用時，效果最為顯著。
　　四、IL-17、IL-34顯著促進MC3T3-E1細胞PGE2蛋白的表達。IL-17、IL-34聯(lián)合作用時，效果最為顯著。
　　結論：
　　一、IL-17、IL-34在體外實驗中可以顯著抑制MC3T3-E1細胞的增殖能力，并顯著影響細胞周期的分布，揭示IL-17、IL-34可能