ClC-7影響牙發(fā)生的體內研究.pdf

1、在前期課題組的臨床和基礎研究中,我們發(fā)現牙的發(fā)育和ClC-7分子密切相關。一方面表現在CLCN7基因突變所引起的骨硬化癥患者,可出現牙根發(fā)育不全及牙萌出受阻,部分牙有釉質發(fā)育不全等異常表現;另一方面,CLC-7蛋白在胚胎時期小鼠及出生后P1小鼠的牙胚中均有表達。所以,我們認為ClC-7在牙發(fā)育中可能起到了非常重要的作用。為驗證該假說,本實驗采用殼聚糖作為siRNA載體,對Clcn7-siRNA進行包裹,以保護siRNA免受核酸酶的降解及

2、提高細胞攝取率;然后通過頜骨局部注射CS-Clcn7-siRNA納米粒溶液的方法,使Clcn7-siRNA分布于特定牙胚及其周圍組織,從而觀察當牙胚局部Clcn7基因水平下降時,其牙胚發(fā)育的特征。
　　方法:
　　實驗一:選取新生小鼠上頜第一磨牙為研究對象,進行Cy5.5-siRNA的CS包裹后注射,通過小動物活體成像技術,比較腹腔注射和牙胚局部注射對牙胚局部的影響,探索和確定一種研究牙胚中基因的頜骨局部注射siRNA的方法

3、。
　　實驗二:使用建立的頜骨局部注射法將CS-Clcn7-siRNA納米粒溶液局部注射于牙胚周圍,通過石蠟切片H&E染色和Micro-CT掃描,觀察注射后不同階段牙發(fā)育的特征,包括牙胚組織的相關細胞或結構,如成釉細胞、成牙本質細胞、牙釉質和牙本質等的形成和變化規(guī)律,驗證Clcn7在牙發(fā)育中的作用。
　　實驗三:用免疫組化的方式比較對照組和實驗組在CLC-7表達上的區(qū)別,判斷CS-siRNA納米粒溶液沉默Clcn7的有效性。

4、
　　結果:
　　1.CS-siRNA納米粒溶液腹腔注射后的熒光分布和強度:隨著時間的延長,熒光在腹腔內的分布范圍先擴大,后縮小;強度先增強,后減弱。牙胚處始終沒有檢測出熒光分布。分離的上頜骨牙胚處不能檢測出熒光。
　　2.局部注射法的建立:首先,注射藍色染料后,探針挖出牙胚成藍色;其次,小動物活體成像結果顯示,于左側上頜第一磨牙牙胚處注射CS-Cy5.5-siRNA納米粒溶液后,上頜骨牙胚處有熒光;最后,牙胚組織冰凍

5、切片在小動物活體成像下顯示牙胚處有熒光,且 H&E染色結果顯示牙胚組織結構完好。
　　3.石蠟切片H&E染色和Micro-CT結果顯示,實驗組牙胚的成釉細胞和成牙本質細胞受到影響,牙釉質、牙本質發(fā)育和牙萌出障礙,牙形態(tài)結構紊亂。
　　4.P4小鼠石蠟切片免疫組化染色結果顯示,對照組小鼠CLC-7蛋白在牙胚內的成釉細胞陽性結果表達最強,成牙本質細胞和部分的牙乳頭細胞表達其次強,星網狀層上的CLC-7表達相對較弱。實驗組小鼠CL

6、C-7蛋白在牙胚內部分的牙乳頭細胞、成牙本質細胞、成釉細胞和星網狀層細胞內陽性表達降低或不表達。
　　結論:
　　1.腹腔注射方法目前不能將CS-siRNA有效遞送至頜骨和牙胚組織。局部注射方法具有定位性強和效應局限等特征,可用于降低小鼠上頜第一磨牙的局部基因表達。
　　2.局部注射CS-Clcn7-siRNA用以沉默牙胚中Clcn7基因的方法可行,此方法為研究小鼠牙胚中其他基因的作用提供了新的研究途徑。
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7、.Clcn7基因局部沉默后可影響牙釉質和牙本質的發(fā)育、牙形態(tài)、牙根的發(fā)育和牙的萌出。
　　本課題通過局部注射CS-Clcn7-siRNA的方法,首次將CS-siRNA應用于頜骨局部,有效地觀察了Clcn7基因在局部沉默后對牙胚發(fā)育的影響。我們認為Clcn7基因可能是通過成釉細胞和成牙本質細胞對牙釉質和牙本質的形成產生影響;通過對牙乳頭形態(tài)的影響,參與調控牙形態(tài)特征;通過影響牙胚周圍組織和細胞,影響牙根發(fā)育。本課題不僅通過載體包裹s