抑癌基因Tg737在肝癌發(fā)病機制中作用的初步研究.pdf

1、肝癌是我國常見惡性腫瘤之一，其死亡率在惡性腫瘤中僅次于胃、食道而居第三位。在我國每年約有11萬人死于肝癌，占全世界肝癌死亡人數(shù)的45％。研究表明原發(fā)性肝癌的預后比較差的主要原因是缺乏特異的早期診斷指標和治療手段，而研究肝癌的發(fā)病機理有助于提高肝癌的早期診斷率，指導肝癌的正確治療。
　　Tg737基因是近年發(fā)現(xiàn)的一種肝癌抑癌基因，最初進行研究時發(fā)現(xiàn)該基因與遺傳性多囊腎?。╝utosomal recessive polycystic

2、kidney disease,ARPKD）orpk鼠突變模型研究中的目的基因相同。但到目前為止，對于Tg737基因在肝癌發(fā)病過程中的如何發(fā)揮作用并不十分清楚。因此，進一步揭示Tg737基因的生物學功能，豐富和發(fā)展肝癌發(fā)生發(fā)展理論，為肝癌早期診斷及治療提供依據(jù)有著十分重要的意義。
　　本研究共分三個部分：
　　第一部分：Tg737基因在肝癌中的表達及相關(guān)性研究
　　目的：觀察Tg737基因在肝癌組織和細胞中的表達，并分析

3、其與肝癌的相關(guān)性。
　　方法：采用RT-PCR和Western blot方法檢測人肝癌組織和肝癌細胞系中Tg737mRNA和蛋白的表達，并通過統(tǒng)計學方法對表達情況與肝癌的相關(guān)性進行分析。
　　結(jié)果：人正常肝細胞系HL-7702中Tg737的mRNA表達和蛋白表達水平均高于肝癌細胞HepG2和MHCC97。65例肝癌組織標本中有30例Tg737mRNA表達呈陽性，且表達水平較相應(yīng)癌旁組織低；34例檢測出Tg737蛋白的陽性表達

4、。而65例癌旁組織中有61例檢測出Tg737mRNA的陽性表達；59例Tg737蛋白表達呈陽性。18例早期（Ⅰ-Ⅱ）肝癌組織中15例Tg737蛋白表達呈陽性，47例中晚期（Ⅲ-Ⅳ）肝癌中19例呈陽性，二者比較有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)論：Tg737基因作為肝癌的抑癌基因，其表達下調(diào)可能是肝癌發(fā)生、發(fā)展過程中的重要因素，檢測Tg737基因的表達可能作為判斷肝癌分期的參考指標。
　　第二部分：Tg737基因?qū)Ω伟┘毎钚缘挠绊?br

5、>　　目的：構(gòu)建Tg737基因的真核表達載體，并將其導入肝癌細胞中，觀察該基因?qū)θ烁伟┘毎鲋郴钚缘挠绊憽?br>　　方法：以臨床獲取的人正常肝組織的mRNA為模板，通過RT-PCR方法獲得Tg737基因全長序列，將其克隆至pEGFP-C1載體，進行序列、酶切鑒定。將HepG2細胞隨機分為三組：HepG2-Tg737組（pEGFP-Tg737轉(zhuǎn)染組）、HepG2-vect組（空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組）和HepG2組（空白對照組），利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將

6、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至肝癌細胞系HepG2中；通過Real-time PCR及Western blot方法明確轉(zhuǎn)染48h后，各組細胞中Tg737的表達情況，并通過流式細胞儀和MTT比色法觀察其對細胞周期和活性的影響。
　　結(jié)果：我們成功構(gòu)建了真核表達載體pEGFP-Tg737，將其轉(zhuǎn)染至肝癌細胞系HepG248h后，HepG2-Tg737組細胞中Tg737mRNA和蛋白的表達水平均明顯高于HepG2-vect組和HepG2組。與其它兩組相

7、比，HepG2-Tg737組細胞生長明顯受到抑制，G1期細胞比例高于HepG2-vect組和HepG2組，S期細胞比例明顯較低。
　　結(jié)論：Tg737基因能夠過表達于肝癌細胞HepG2中，并可抑制該細胞的增殖能力。
　　第三部分肝癌中Tg737基因雜合性缺失的研究
　　目的：檢測肝癌中Tg737基因的雜合性缺失情況，并分析微衛(wèi)星位點雜合性缺失與臨床病理特征的關(guān)系。
　　方法：應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性技術(shù)（

8、PCR-SSCP）檢測Tg737基因的五個微衛(wèi)星位點(RH65721、RH118612、SHGC-57879、STS-U20362和G64212)雜合性缺失情況，并通過統(tǒng)計學方法對缺失情況與肝癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性進行分析。
　　結(jié)果：Tg737基因的五個微衛(wèi)星位點RH65721、RH118612、SHGC-57879、STS-U20362和G64212的LOH發(fā)生頻率分別為61.54％(32/65)、52.31％(34/65)、

9、65.45％(36/65)、58.33％(28/65)、74.47％(35/65)；五個位點之間的LOH發(fā)生率差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。微衛(wèi)星位點SHGC-57879和G64212的LOH發(fā)生率與肝癌的轉(zhuǎn)移及TNM分期相關(guān)（P<0.05）。
　　結(jié)論：Tg737基因在肝癌中存在較大比例的雜合性缺失，其微衛(wèi)星位點表現(xiàn)出較高的不穩(wěn)定性，影響基因的表達。
　　通過以上的研究，初步證實了Tg737基因在肝癌發(fā)生的過程中發(fā)揮著