分別作用于hTERT和ATP6L的RNA干擾對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的抑制作用.pdf

1、腫瘤細(xì)胞的兩大特征是無(wú)限增殖和侵襲轉(zhuǎn)移。端粒酶異常活躍是細(xì)胞永生化的重要原因，因此成為抑瘤靶點(diǎn)。腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移與細(xì)胞外基質(zhì)的分解密切相關(guān)。侵襲性實(shí)體瘤細(xì)胞周圍較正常細(xì)胞有較低的pH，這主要與腫瘤細(xì)胞膜上氫泵V-ATPase活性通常增高、促氫離子外排有關(guān)。酸性條件有利于蛋白水解酶激活和消化細(xì)胞外基質(zhì)，從而利于細(xì)胞侵襲。本文用基于DNA質(zhì)粒的RNAi干擾技術(shù)分別抑制高轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞株HCCLM3端粒酶亞基hTERT和V-ATPase

2、的ATP6L亞基表達(dá)，以達(dá)到抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的目的。
　　 構(gòu)建針對(duì)hTERT靶基因的siRNA表達(dá)質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)染HCCLM3。HCCLM3轉(zhuǎn)染siRNA表達(dá)質(zhì)粒載體后western blot顯示hTERT被抑制；用TRAP和ELISA方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的端粒酶活性，結(jié)果顯示端粒酶活性降低。MTT方法繪制的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線顯示hTERT.被抑制的轉(zhuǎn)染細(xì)胞增殖減慢。
　　 構(gòu)建針對(duì)ATP6L靶基因的siRNA表達(dá)質(zhì)粒載體

3、，轉(zhuǎn)染HCCLM3，經(jīng)G418篩選的轉(zhuǎn)染細(xì)胞命名為si-A-M3。northern blot結(jié)果顯示si-A-M3的ATP6L被抑制～60％。用pH敏感熒光染料BCECF/BCECF-AM結(jié)合實(shí)時(shí)熒光分光光度計(jì)方法分析細(xì)胞培養(yǎng)液pH和細(xì)胞內(nèi)pH(pHi)的變化以分析si-A-M3的泌氫功能，結(jié)果為：①sj-A-M3培養(yǎng)液培養(yǎng)12小時(shí)后pHi的變化顯示細(xì)胞泌氫較對(duì)照組減少；②si-A-M3內(nèi)pH在NH4Cl誘導(dǎo)酸化后，去除NH4+后恢復(fù)速

4、度明顯減慢，且不能恢復(fù)到靜息pHi；③用細(xì)胞內(nèi)緩沖能力校正測(cè)得si-A-M3 pHi酸化后去除NH4+的即時(shí)排氫量明顯降低。上述結(jié)果提示轉(zhuǎn)染細(xì)胞的V-ATPase功能被抑制。分解細(xì)胞外基質(zhì)的的蛋白水解酶受pH調(diào)節(jié)。V-ATPase功能被抑制的同時(shí)MMP-2/9受到影響。western blot結(jié)果顯示si-A-M3的MMP-2表達(dá)降低，用ELISA方法和酶譜測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP-2/9活性以及用FITC-標(biāo)記的gelatin原位顯

5、示移植瘤細(xì)胞周圍MMP-2/9活性，均發(fā)現(xiàn)si-A-M3的MMP-2/9活性下調(diào)。體外培養(yǎng)si-A-M3的侵襲實(shí)驗(yàn)顯示si-A-M3的侵襲力明顯下降；在小鼠[BalB/c(nu+/nu+)]肝原位移植瘤模型中發(fā)現(xiàn)si-A-M3組肝內(nèi)轉(zhuǎn)移率和肺轉(zhuǎn)移率明顯降低，si-A-M3組肝原位生長(zhǎng)的腫瘤體積明顯小于對(duì)照組。綜合上述結(jié)果，HCCLM3細(xì)胞的ATP6L被抑制后，細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移和生長(zhǎng)受抑制，與細(xì)胞的V-ATPase功能被抑制及其MMP-2表達(dá)