RNA干擾技術(shù)對(duì)食管癌細(xì)胞Survivin基因表達(dá)的抑制作用及其促凋亡研究.pdf

1、第一部分:食管癌組織中survivin蛋白的表達(dá)及其臨床意義
　　目的: Survivin基因與腫瘤的發(fā)生、生長(zhǎng)和侵襲有關(guān),但其在食管癌發(fā)病機(jī)理中的作用尚未明確。本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)食管癌組織中survivin蛋白的表達(dá),確定survivin基因在人食管癌組織中的表達(dá)水平,并探討其臨床意義。
　　方法:以汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理檢驗(yàn)科05年9月至12月的38例食管癌患者手術(shù)切除標(biāo)本為材料,其中男性31例,女性7例。年齡4

2、1-78歲,中位年齡58歲。采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)survivin蛋白的表達(dá),對(duì)結(jié)果行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果:38例食管鱗癌中,survivin陽(yáng)性24例,表達(dá)率為63.16％(24/38);遠(yuǎn)端正常對(duì)照組未見(jiàn)survivin陽(yáng)性表達(dá)。Survivin陽(yáng)性表達(dá)與年齡、腫瘤分化程度相關(guān);但與性別和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)明顯相關(guān)性。
　　結(jié)論:Survivin蛋白在食管癌組織表達(dá)上調(diào);Survivin基因可能成為食管癌基因治療的靶點(diǎn)。<

3、br>　　第二部分:RNA干擾表達(dá)載體抑EC-109細(xì)胞Survivin基因表達(dá)的體外研究
　　目的:構(gòu)建針對(duì)Survivin基因的RNA干擾表達(dá)載體,應(yīng)用RNA干擾技術(shù)(RNAi)研究針對(duì)Survivin基因的siRNA,抑制Survivin基因表達(dá)并誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞系EC-109細(xì)胞的凋亡。
　　方法:EC-109細(xì)胞常規(guī)傳代培養(yǎng)。利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建針對(duì)Survivin的siRNA表達(dá)質(zhì)粒pSIREN/S,及對(duì)照質(zhì)粒pS

4、IREN/CN。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至EC-109細(xì)胞,熒光顯微鏡判斷轉(zhuǎn)染效率。蛋白印跡和半定量RT-PCR檢測(cè)Survivin蛋白表達(dá)及基因轉(zhuǎn)錄水平的變化,免疫熒光技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pSIREN/S后Survivin基因在EC-109細(xì)胞的表達(dá)情況。在不同時(shí)間點(diǎn)收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞,提取細(xì)胞基因組DNA,電泳檢查DNA ladder的形成;利用流式細(xì)胞術(shù)觀察siRNA抑制Survivin基因表達(dá)后誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的情況。
　　結(jié)果:熒光顯微鏡結(jié)

5、果顯示,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率達(dá)46.7%。半定量RT-PCR檢測(cè)到pSIREN/S質(zhì)粒在EC-109細(xì)胞內(nèi)對(duì)Survivin基因的轉(zhuǎn)錄抑制率為74.04%;蛋白質(zhì)印跡結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pSIREN/S的EC-109細(xì)胞Survivin蛋白表達(dá)量?jī)H為正常組的41.64%,而對(duì)照質(zhì)粒pSIREN/CN對(duì)Survivin基因的蛋白表達(dá)及轉(zhuǎn)錄均沒(méi)有抑制作用。利用RNA干擾技術(shù)抑制survivin的表達(dá),EC-109細(xì)胞的基因組DNA出現(xiàn)明顯的D