靶向糖基轉移酶shRNA表達質粒對肝癌細胞增殖和遷移能力的抑制作用.pdf

1、一、研究背景
　　 糖蛋白廣泛存在于細胞膜和細胞間質中,由寡糖和蛋白質以共價方式連接而成。絕大多數(shù)寡糖是其相應的糖蛋白的功能中心,在細胞識別、信號傳遞中起關鍵作用。糖鏈的形式有多種,其中N-糖鏈的結構改變足細胞惡性轉化的關鍵步驟。多數(shù)研究證明在腫瘤細胞巾,常發(fā)現(xiàn)糖蛋白結構的異常增加,出現(xiàn)了腫瘤組織“異常糖基化”。發(fā)生這種變化的具體機制尚不清楚,但在大多數(shù)情況下,糖基轉移酶的激活起著主要的作用。
　　 糖基轉移酶在糖蛋白的

2、合成中起關鍵作用。N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶分布于高爾基體,其主要功能是在核心五糖基礎上形成多分支結構,將供體底物UDP-N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)中的GlcNAc(Gn)糖基轉移至N-聚糖五糖核心的兩個甘露糖。N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶至少有6種,其中N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶V(N-acetylglucosaminyltransferase V,GnT-V)是目前研究最多的。在正常體內,GnT-V是參與N-糖鏈生物合成的酶

3、類,是糖蛋白N-糖鏈加工酶之一,具有決定N-糖鏈類型及復雜型糖鏈結構的重要作用。在高爾基體內催化形成N-糖鏈的β1,6分支,將核糖體合成的蛋白進行糖基化修飾。
　　 N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶V(N-acetylglucosaminyltransferase V,GnT-V)除了具有糖基轉移酶催化活性這一特征外,最近有研究表明N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶V是一個高爾基體酶,在某些腫瘤細胞中,可被分泌到培養(yǎng)基中,其分泌機制還不能確定。但

4、是被分泌出細胞的GnT-V在生理濃度范圍內能引起腫瘤血管生成,而腫瘤血管生成是腫瘤轉移的關鍵。
　　 RNAi技術是指在生物體細胞中,外源性或內源性的雙鏈RNA(double2stranded RNA,dsRNA)引起與其同源mRNA的特異性降解,而抑制其相應基因表達的過程。RNA干擾具有高效性,穩(wěn)定性,特異性等優(yōu)點,它選擇性地沉默腫瘤細胞內的癌基因和抑癌基因,抑制其功能表達,分析其表型的改變,有利于揭示腫瘤發(fā)生與病變的分子機制

5、,從而為腫瘤的診斷和治療提供治療靶點。
　　 本課題旨在利用RNA干擾技術,將靶向針對GnT-V的shRNA質粒轉染進肝癌細胞,用cck-8增殖實驗,劃痕實驗,趨化運動試驗以及體內皮下成瘤實驗來觀察肝癌細胞增殖和遷移能力的改變,為肝癌分子靶向治療研究中新靶標的確定提供客觀依據(jù)。
　　 二、研究目的：
　　 將靶向針對高表達基因GnT-V的shRNA表達質粒轉染進人肝癌HepG2細胞,觀察GnT-V的表達變化對He

6、pG2細胞體外及體內增殖和遷移能力的影響,為肝癌分子靶向治療研究中新靶標的確定提供客觀依據(jù)。
　　 三、實驗方法
　　 1、pGPU6/GFP/Neo GnT-VshRNA質粒的構建及鑒定已由本課題組成員賀富麗完成,方法如下:
　　 a.GnT-V siRNA序列的設計:按照siRNA設計原則,利用Ambion公司提供的“siRNA Target Finder and Design Tools”,根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)

7、庫中GnT-V基因(NM 002410.3)cDNA,設計針對GnT-VcDNA的RNA片段,序列分別如下:sense 5' GGAAGTGCATGCAACTGTTTA 3',sense 5' CTCCTTTGACCCTAAGAAT3'。分別命名為GnT-V/1564和GnT-V/2224。將其中一對的序列打亂排列,經(jīng)Blast比對,無任何同源性超過70％的序列,作為陰性對照干擾序列,序列如下:sense 5'GTTCTCCGAACGT

8、GTCACGT 3',命名為GnT-V/NC。
　　 b.shRNA轉錄模板DNA的設計:根據(jù)前面設計的siRNA序列,設計模板DNA鏈,其順序分別為Bbs I酶切位點、正義序列、9nt loop連接序列、反義序列、RNA聚合酶Ⅲ終止子(6個T)、BamH Ⅰ酶切位點。
　　 c.質粒pGPU6/GFP/Neo GnT-V的構建及鑒定:先將各組2條模板單鏈退火處理,再與雙酶切后的pGPU6/GFP/Neo質粒連接,構建成

9、重組體質粒。將重組體轉化大腸桿菌DH5 α,篩選卡那霉素抗性克隆,利用限制性內切酶Bbs Ⅰ和BamH Ⅰ雙酶切及測序鑒定重組質粒。大量擴增搖菌后,抽提質粒純化。
　　 2、細胞培養(yǎng)
　　 人肝癌細胞株HepG2在37℃ 5％CO2條件下,培養(yǎng)于含10％新生牛血清的RPMI-1640中,每周傳代2～3次。HepG2細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期,用脂質體Lipofectamine2000TM將質粒導入HepG2細胞。用G418篩選

10、陽性細胞克隆。
　　 3、細胞轉染
　　 HepG2細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期,用脂質體Lipofectamine2000TM將質粒導入HepG2細胞。用G418篩選陽性細胞克隆。
　　 4、pGPU6/GFP/Neo GnT-V shRNA干擾效果檢測
　　 a.RT-PCR測定GnT-V mRNA
　　 用Trizol提取對數(shù)生長期的單層培養(yǎng)細胞總RNA,采用AMV逆轉錄合成cDNA.GnT-V上游

11、引物為5'AACTCTTGGACCATCCTGGGTTC 3',下游引物為5'TTGCTGCTTTTGGGTGGGTT 3'。β-actin作為內參,上游引物為5'GAAACTACCTTCAACTCCATC 3 ' 下 游 引 物 為 5 'CGAGGCCAGGATGGAGCCGCC 3'。反應條件為:94℃預變性5min,94℃變性30s,58℃退火30s,72℃延伸30s,共36個循環(huán),最后72℃再延伸10min。GnT-V擴增產(chǎn)物

12、長度為555bp,β-actin長度為219bp。電泳后UVI凝膠成像系統(tǒng)攝像,Image-Pro Plus 6.0軟件分析條帶灰度值,用GnT-V/β-actin代表GnT-V的相對表達量。
　　 b.Western blot檢測GnT-V蛋白表達
　　 提取總蛋白,用測定蛋白濃度,吸取50μg總蛋白,去離子水補至20μL,加入等體積2×上樣buffer煮沸7min,離心后吸取30μL上樣,經(jīng)不連續(xù)SDS-PAGE電泳

13、分離后,用半干法電轉移至PVDF膜上,5％脫脂奶粉37℃封閉2h,TBST洗膜后用羊抗人GnT-V蛋白多克隆抗體(1:200)、鼠抗人GAPDH蛋白單克隆抗體(1:1000)4℃孵育過夜,洗膜后分別加入HRP標記的兔抗羊IgG(1:500)、HRP標記的羊抗鼠IgG(1:5000),室溫下?lián)u動1h,洗膜后用ECL化學發(fā)光系統(tǒng)檢測,暗室曝光X線片,沖洗膠片,UVI凝膠成像系統(tǒng)攝像,Image-Pro Plus 6.0軟件分析條帶灰度值,用

14、GnT-V/GAPDH代表GnT-V的相對表達量。
　　 5、CCK-8檢測pGPU6/GFP/Neo GriT-V shRNA干擾后對HepG2細胞增殖能力的影響
　　 取HepG2 GnT-V/1564和HepG2 GnT-V/NC對數(shù)生長期的待測細胞,CCK-8法分析不同時間點的細胞活力(0h、24h、48h、72h、96h),每個時間點分別檢測6個復孔。測量兩組的OD450nm值,繪制生長曲線,并計算HepG2

15、GnT-V/1564的生長抑制率。細胞生長抑制率(IR)=(對照組OD450值-干擾組OD450值)/對照組OD450值×100％。
　　 6、pGPU6/GFP/Neo GnT-VshRYA干擾后對HepG2細胞遷移能力的影響
　　 a.趨化運動實驗
　　 取HepG2 GnT-V/1564和HepG2 GnT-V/NC對數(shù)生長期的細胞,用無血清RPMI1640培養(yǎng)過夜。通過24孔趨化小室檢測細胞遷移性,趨化因

16、子為10％新生牛血清。計算穿過聚碳酸酯膜的細胞數(shù),顯微鏡下每個復孔隨機取5個高倍鏡視野計數(shù)(400×)。
　　 b.劃痕愈合實驗
　　 取HepG2 GnT-V/1564和HepG2 GnT-V/NC對數(shù)生長期的待測細胞,細胞接種于包被CollagenⅣ的6孔板,培養(yǎng)至細胞呈單層貼壁生長狀態(tài)。分別在各組單細胞層上劃痕,用含10％FBS的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)以使劃痕愈合。分別于劃痕后0h、12h、24h、36 h每個孔取4個視野

17、拍照,觀察劃痕愈合能力,用愈合率代表愈合能力。愈合率=[(愈合前兩側細胞層距離-愈合后兩側細胞層距離)/愈合前兩側細胞層距離]×100％。
　　 7、裸鼠成痛實驗
　　 取HepG2 GnT-V/1564和HepG2 GnT-V/NC對數(shù)生長期的細胞,調整細胞濃度為2.5×107/mL,按100μL/只進行臀部皮下注射。左臀部:HepG2 GnT-V/NC組,右臀部:HepG2 GnT-V/1564組。
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18、、統(tǒng)計學分析
　　 實驗結果均經(jīng)SPSS13.0軟件統(tǒng)計。兩組比較采用t檢驗,多組比較采用方差分析,以P<0.05表示有統(tǒng)計學意義。
　　 四、結論
　　 1、pGPU6/GFP/Neo GnT-V shRNA真核表達質粒可以顯著下調GnT-VmRNA和蛋白表達量。
　　 2、下調GnT-V的表達后,HepG2細胞的體外增殖和遷移能力受到抑制。
　　 3、下調GnT-V的表達后,HepG2細胞的體