大豆異黃酮對(duì)負(fù)載于脫細(xì)胞羊膜上軟骨細(xì)胞的影響.pdf

1、目的：探討不同濃度大豆異黃酮（10-9、10-8、10-7mol/L）對(duì)負(fù)載于脫細(xì)胞羊膜上軟骨細(xì)胞的影響，為以軟骨細(xì)胞為種子細(xì)胞的軟骨組織工程的臨床應(yīng)用及基礎(chǔ)研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法：健康4周齡幼兔，處死后在無(wú)菌條件下取雙上、下肢關(guān)節(jié)的軟骨，分離軟骨細(xì)胞，傳代培養(yǎng)。取第3、4代軟骨進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色及II膠原免疫組化染色。II型酶消化法和物理刮除法制備脫細(xì)胞羊膜，亞甲藍(lán)染色觀察脫細(xì)胞的程度，掃描電鏡觀察脫細(xì)胞羊膜結(jié)構(gòu)。取第2代軟骨細(xì)

2、胞接種到脫細(xì)胞羊膜上，實(shí)驗(yàn)組分別加入含10-9、10-8、10-7mol/L大豆異黃酮的DMEM/F-12培養(yǎng)液（10％FBS），對(duì)照組加入不含大豆異黃酮的DMEM/F-12培養(yǎng)液（10%FBS）。倒置顯微鏡下觀察負(fù)載于脫細(xì)胞羊膜上軟骨細(xì)胞的形態(tài)，甲苯胺藍(lán)染色觀察軟骨細(xì)胞與脫細(xì)胞羊膜的復(fù)合。MTT法檢測(cè)各組軟骨細(xì)胞的增殖，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)和上清液中蛋白多糖（PG）、II型膠原的含量；提取細(xì)胞總RNA，RT-PCR方

3、法定量檢測(cè)各組軟骨細(xì)胞胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）mRNA基因相對(duì)表達(dá)量。
　　結(jié)果：原代分離、貼壁生長(zhǎng)的軟骨細(xì)胞多呈三角型、梭型，培養(yǎng)至5天時(shí)，鋪滿瓶底，呈“鋪路石”狀；常規(guī)傳代培養(yǎng)3代，細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯改變。亞甲藍(lán)染色顯示，經(jīng)酶消化法和物理刮除法制備的脫細(xì)胞羊膜上未見(jiàn)異染藍(lán)色細(xì)胞。掃描電鏡觀察可見(jiàn)脫細(xì)胞羊膜主要成分為網(wǎng)狀纖維結(jié)構(gòu)，較致密，孔隙大小不一，纖維相互交織呈網(wǎng)狀。第2代軟骨細(xì)胞接種

4、到脫細(xì)胞羊膜1天后，可見(jiàn)部分軟骨細(xì)胞伸出偽足，細(xì)胞呈圓形或三角形。軟骨細(xì)胞復(fù)合在脫細(xì)胞羊膜上4天后，甲苯胺藍(lán)染色顯示細(xì)胞形態(tài)仍為三角型和梭型，基質(zhì)藍(lán)染，細(xì)胞核呈深藍(lán)色。MTT結(jié)果顯示：10-9、10-8、10-7mol/L大豆異黃酮對(duì)負(fù)載于脫細(xì)胞羊膜上第2天的軟骨細(xì)胞的增殖無(wú)明顯的促進(jìn)作用，與對(duì)照組比較無(wú)明顯差異（P>0.05），第3天時(shí)，10-7mol/L大豆異黃酮組開(kāi)始促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖，明顯高于對(duì)照組（P<0.05），從第4天開(kāi)始

5、，10-9、10-8、10-7mol/L大豆異黃酮對(duì)負(fù)載于脫細(xì)胞羊膜上的軟骨細(xì)胞的增殖均顯示促進(jìn)作用，明顯高于對(duì)照組（P<0.05），10-9、10-8mol/L兩組之間無(wú)明顯差異（P>0.05）。ELISA法檢測(cè)結(jié)果顯示：大豆異黃酮可促進(jìn)負(fù)載于脫細(xì)胞羊膜上的軟骨細(xì)胞II型膠原的分泌，具有一定的劑量依賴性，然而只有10-7mol/L大豆異黃酮促進(jìn)負(fù)載于脫細(xì)胞羊膜上的軟骨細(xì)胞蛋白多糖的分泌。RT-PCR結(jié)果顯示大豆異黃酮可促進(jìn)負(fù)載于脫細(xì)胞

6、羊膜上的軟骨細(xì)胞表達(dá)IGF-1、BMP-2 mRNA，表達(dá)量明顯高于對(duì)照組（P<0.05），且具有一定的劑量依賴性。
　　結(jié)論：1體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞，3代以內(nèi)適宜作為組織工程軟骨種子細(xì)胞，3代以后軟骨細(xì)胞出現(xiàn)去分化現(xiàn)象。2脫細(xì)胞羊膜可作為軟骨組織工程支架材料，并且可與軟骨細(xì)胞良好復(fù)合。310-9、10-8、10-7 mol/L大豆異黃酮對(duì)負(fù)載于脫細(xì)胞羊膜上軟骨細(xì)胞的增殖和分化具有一定的促進(jìn)作用，表現(xiàn)在10-9、10-8、10-7