白色念珠菌與人口腔上皮細(xì)胞相互作用的研究：ALS基因表達(dá)與IL-8分泌.pdf

1、白色念珠菌又稱白假絲酵母菌，是一種重要的條件致病真菌，可導(dǎo)致皮膚、黏膜及系統(tǒng)彌散性念珠菌病。隨著器官移植、癌癥患者侵襲性治療的普及和艾滋病患者的逐漸增加，臨床上口腔和系統(tǒng)性念珠菌感染越來越常見。念珠菌對(duì)宿主的粘附是其致病的第一步，也是最關(guān)鍵的一步。明確其粘附機(jī)制，對(duì)預(yù)防及控制白色念珠菌病具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)口腔念珠菌感染患者分離的念珠菌株3683、系統(tǒng)感染患者血液分離的念珠菌株SC5314以及皮膚感染患者指甲分離的念珠菌株3630，在

2、小鼠感染模型中的致病力有較大的差異，不同菌株對(duì)黏膜的粘附力和宿主的免疫應(yīng)答不同可能是這種差異的原因之一。白色念珠菌ALS家族基因是其粘附相關(guān)的重要基因。而念珠菌感染后，宿主可產(chǎn)生細(xì)胞因子如IL-8，抵御其粘附和入侵。因此檢測(cè)不同念珠菌感染后其ALS基因表達(dá)及宿主分泌細(xì)胞因子的情況，有助于闡釋白色念珠菌致病力差異的原因，揭示白色念珠菌感染口腔上皮的作用機(jī)制。
　　 目的：研究三株白色念珠菌對(duì)人口腔上皮細(xì)胞粘附能力的差異，并初步探討

3、這種差異產(chǎn)生的原因。
　　 方法：①分別取1×107/ml三株念珠菌與1×105/ml口腔上皮細(xì)胞(包括頰上皮細(xì)胞和牙齦細(xì)胞)各0.5ml混合，37℃孵育1h，收集混合物，離心。革蘭染色，鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)50個(gè)上皮細(xì)胞，計(jì)算每個(gè)口腔上皮細(xì)胞粘附的白色念珠菌數(shù)目。②三株念珠菌分別與口腔上皮細(xì)胞以10∶1的比例混合培養(yǎng)，6h、12h和24h收集頰細(xì)胞混合物，24h和48h收集牙齦細(xì)胞混合物，離心，去上清，保留沉淀物進(jìn)行熒光定量RT-PC

4、R實(shí)驗(yàn)。③三株念珠菌分別與口腔上皮細(xì)胞以1∶1的比例混合培養(yǎng)，6h、12h和24h收集頰細(xì)胞混合物，24h和48h收集牙齦細(xì)胞混合物，離心，收集上清，ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子IL-8、IL-12分泌量。④三株念珠菌分別與牙齦上皮細(xì)胞以10∶1的比例混合培養(yǎng)，分別加入IL-8(7000pg/ml)、IL-12(1000pg/ml)，24h、48h時(shí)收集樣本，離心，沉淀物貯存于-80℃，熒光定量PCR檢測(cè)ALS1表達(dá)量。所得數(shù)據(jù)結(jié)果均用((-

5、x)±s)表示，用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 結(jié)果：①每個(gè)頰上皮細(xì)胞粘附的念珠菌數(shù)目不同，平均每個(gè)上皮細(xì)胞上粘附菌株3683為14.61±0.54，SC5314為12.55±0.53，3630為12.62±0.50，其中3683對(duì)上皮的粘附能力最強(qiáng)，與其余兩株相比差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。②與頰上皮細(xì)胞共培養(yǎng)6h后，菌株3683表達(dá)ALS1-3水平最高，分別為ALS1相對(duì)表達(dá)量82.42±19.50(p＜0.

6、05)，ALS2相對(duì)表達(dá)量43.74±5.10(p＜0.05)，ALS3相對(duì)表達(dá)量2.13±0.61(p＞0.05)，3630次之，SC5314最低。隨著共培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，三株念珠菌ALS1-3表達(dá)量降低。牙齦上皮細(xì)胞組ALS1-3基因表達(dá)量均低于頰上皮細(xì)胞組。③牙齦上皮細(xì)胞與三株念珠菌共培養(yǎng)后分泌IL-8量不同，IL-8分泌量24hSC5314組(207.07±44.60)pg/ml，3630組(142.39±9.99)pg/ml，36

7、83組(202.63±9.36)pg/ml；48h SC5314組(262.95±27.42)pg/ml，3630組(198.81±6.98)pg/ml，3683組(267.68±10.79)pg/ml，但實(shí)驗(yàn)組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。對(duì)照組所有時(shí)間點(diǎn)IL-8分泌量均高于實(shí)驗(yàn)組(p＜0.05)。三株念珠菌與牙齦細(xì)胞共培養(yǎng)后IL-12分泌量各組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。頰上皮細(xì)胞不分泌細(xì)胞因子IL-8/IL-12。④

8、48h IL-8/IL-12均明顯抑制念珠菌ALS1表達(dá)。加入IL-8菌株SC5314、3630和3683 ALS1表達(dá)量分別下調(diào)95.3％，79.1％，93.1％。加入細(xì)胞因子IL-12后，菌株SC5314、3630和3683 ALS1表達(dá)量分別下調(diào)50％，51.1％，70.6％，與各自同一時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　 結(jié)論：①三株念珠菌對(duì)頰上皮細(xì)胞粘附力不同，菌株3683 ALS1-3表達(dá)水平