重組Dsg3EC-,1-2-嵌合毒素對尋常型天皰瘡?fù)庵苎猅、B淋巴細(xì)胞的影響.pdf

1、目的:天皰瘡是一類由自身抗體介導(dǎo)的慢性、器官特異性、自身免疫性大皰性皮膚病,以患者體內(nèi)出現(xiàn)針對表皮角質(zhì)形成細(xì)胞表面天皰瘡抗原的特異性IgG引起棘層松解為特征.天皰瘡發(fā)病中同時存在細(xì)胞免疫和體液免疫紊亂.天皰瘡抗原刺激B細(xì)胞產(chǎn)生自身抗體是導(dǎo)致天皰瘡發(fā)病的主要因素,而B細(xì)胞產(chǎn)生自身抗體是T細(xì)胞依賴性的.該實驗選取含有能被尋常型天皰瘡患者血漿中的"致病性抗體"特異性識別,含有"免疫優(yōu)勢表位"或稱"致病性表位"的天皰瘡抗原胞外結(jié)構(gòu)域Dsg3EC

2、<,1-2>基因片段,經(jīng)原核表達(dá)獲得重組嵌合毒素Dsg3EC<,1-2>PE40,并分離尋常型天皰瘡患者的外周血PBMC,分別觀察重組嵌合毒素對尋常型天皰瘡患者外周血T、B淋巴細(xì)胞的影響,為進(jìn)一步探討尋常型天皰瘡的靶向生物學(xué)治療奠定基礎(chǔ).方法:在BL21trxB(DE3)中對重組嵌合毒素Dsg3EC<,1-2>PE40進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),經(jīng)免疫蛋白印跡試驗對重組嵌合毒素進(jìn)行鑒定并用IMAC方法進(jìn)行純化.在此基礎(chǔ)上,分離尋常型天皰瘡患者PBMC

3、,并進(jìn)一步分離出T淋巴細(xì)胞,分別以不同濃度的重組嵌合毒素作用于天皰瘡患者的T、B淋巴細(xì)胞,通過ELISPOT方法從單個細(xì)胞水平檢測抗體分泌B細(xì)胞的變化,并通過MTT比色試驗及<'3>H-TdR摻入試驗來觀察重組嵌合毒素對T細(xì)胞的代謝及增殖的影響.結(jié)果:1. Dsg3EC<,1-2>PE40在BL21trxB(DE3)中以可溶性形式表達(dá),而Dsg3EC<,1-2>在AD494(DE3)中則以包涵體形式表達(dá);從各時相的表達(dá)情況看到,Dsg3

4、EC<,1-2>的表達(dá)量隨時間延長而增加,而Dsg3EC<,1-2>PE40表達(dá)量隨時間延長而增加的趨勢不明顯.2. Western Blotting結(jié)果顯示重組嵌合毒素蛋白能夠特異性與Pab IgG結(jié)合,而與正常人IgG不能發(fā)生結(jié)合.3. 純化后的重組嵌合毒素經(jīng)濃縮后,終濃度達(dá)547μg/ml,用Quantity One軟件分析其純度達(dá)80﹪以上.4. ELISPOT結(jié)果顯示,與Dsg3EC<,1-2>相比,重組嵌合毒素可使PV患者外

5、周血PBMC中的抗體分泌B細(xì)胞數(shù)量減少約40﹪左右;5. MTT試驗及<'3>H-TdR摻入試驗結(jié)果可見在Dsg3EC1-2PE40作用下,T細(xì)胞的代謝、增殖較重組Dsg3EC<,1-2>明顯降低,二者間具有顯著性差異,且當(dāng)重組嵌合毒素的濃度達(dá)到約25μg/ml時,其作用趨于穩(wěn)定.結(jié)論:1. 對含有天皰瘡抗原Dsg3抗原優(yōu)勢表位的Dsg3EC<,1-2>片段及其重組嵌合毒素Dsg3EC<,1-2>PE40成功進(jìn)行了原核表達(dá)、純化和鑒定,

6、所得重組嵌合毒素能夠滿足實驗的需要,為深入研究其生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ).2. 重組嵌合毒素能夠特異性與PabIgG結(jié)合,而與正常人IgG不發(fā)生結(jié)合.3. 重組嵌合毒素分子可以降低PV患者外周血抗體產(chǎn)生B細(xì)胞的抗體產(chǎn)生作用.同重組Dsg3EC<,1-2>相比,抗體產(chǎn)生B細(xì)胞數(shù)量減少達(dá)40﹪左右.4. 重組嵌合毒素對PV患者的外周血T細(xì)胞具有抑制或殺傷作用,與Dsg3EC<,1-2>比較,Dsg3EC<,1-2>PE40可使其增殖代謝活性明顯