人類嗜T淋巴細胞病毒Ⅰ型重組env抗原的表達.pdf

1、背景和目的：人類嗜T淋巴細胞病毒(Human T-cell Lymphotropic Virus,HTLV)是最早發(fā)現(xiàn)的人類逆轉錄病毒,其在病毒分類中屬于逆轉錄病毒科腫瘤病毒亞科哺乳類C型病毒。人類嗜T淋巴細胞白血病病毒(HTLV)分為Ⅰ型和Ⅱ型。HTLV-Ⅰ可以導致成人T細胞白血病(adult T cell leukemia/lymphoma,ATL)、熱帶痙攣性麻痹癥/HTLV-Ⅰ相關的脊髓病(Tropical spastic pa

2、raparesis/human T-cell lymphotropicvirus typeⅠ-associated myelopathy,TSP/HAM)等疾病,HTLV-Ⅱ可能與T細胞增生紊亂等有關。HTLV-Ⅰ流行廣泛分布、局部地區(qū)高發(fā)。國內(nèi)10多個省市都發(fā)現(xiàn)了HTLV感染病例,并且發(fā)現(xiàn)在沿海的某些地區(qū)有集中流行。HTLV主要通過輸血、性接觸、哺乳等方式傳播。日本、美國、、法國及其它一些國家和地區(qū)已將其列為獻血員必檢項目。國內(nèi)使用的

3、HTLV-Ⅰ篩檢試劑均為國外試劑,而制約國內(nèi)HTLV-Ⅰ篩檢試劑開發(fā)的瓶頸是其特異性抗原。
　　為此,本實驗采用分子生物學技術,利用原核和真核表達載體表達env重組抗原,為HTLV-Ⅰ篩檢試劑的研制奠定基礎。
　　實驗方法：分析HTLV-Ⅰenv基因和其編碼的gp46蛋白和gp21蛋白的氨基酸序列。選擇抗原決定簇豐富區(qū)(5915nt-6545nt)的630bp基因序列為目的基因。人工合成目的基因,在兩端加上BamHI和Pst

4、Ⅰ酶切位點。將目的基因片段分別克隆進入原核表載體pQE80L和真核表達載體pcDNA4/HisMax-A。利用PCR擴增和BamHI、PstⅠ酶切鑒定重組子pQE80L-env、pcDNA4/HisMax-A-env;然后行序列測定。將pQE80L-env轉入DH5α,1mmol/L IPTG誘導表達;親和層析純化原核表達重組env蛋白抗原。轉染pcDNA4/HisMax-A-env入NIH3T3,培養(yǎng)48h,親和層析純化真核表達重組e

5、nv蛋白抗原。Western-blot檢測原核/真核表達重組env蛋白抗原的活性。利用ELISA方法測試兩種重組env蛋白抗原特異性。
　　實驗結果：1.PCR擴增和BamHI、PstⅠ行酶切篩選得到重組子pQE80L-env和pcDNA4/HisMax-A-env。DNA序列測定證明重組子插入序列與設計一致。2.原核表達,SDS-PAGE分析顯示表達的重組蛋白相對分子質量約25KDa,與預期分子量相符。免疫印跡顯示,在約25KD

6、a有一明顯特異印跡條帶,說明原核表達的重組蛋白具有HTLV-Ⅰenv抗原性。3.轉染細胞培養(yǎng)48h,SDS-PAGE分析,可見相對分子質量約為27KDa目的重組蛋白表達,與預期融合蛋白大小相符。免疫印跡顯示,在約27KDa有明顯特異印跡條帶,說明真核表達的重組蛋白有HTLV-Ⅰenv抗原性。4.原核表達純化的重組env抗原ELISA檢測結果:正常人、HIV陽性和HTLV-Ⅱ陽性的血清均為陰性;HTLV-Ⅰ陽性血清為強陽性。5.真核表達純