重組HLA-G分子對RA外周血T淋巴細(xì)胞抑制作用的研究.pdf

1、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis，RA)是一種以多關(guān)節(jié)損害為特征的自身免疫性疾病。RA的病理改變是滑膜炎、軟骨和軟骨下骨破壞。T淋巴細(xì)胞異?；罨跋蚧そM織的歸巢趨化是RA發(fā)病及活動的重要機制，已有研究證明T淋巴細(xì)胞在RA關(guān)節(jié)腔的浸潤與軟骨及軟骨下骨破壞有密切的關(guān)系[1]。抑制RA的T淋巴細(xì)胞炎性趨化，是治療RA的重要環(huán)節(jié)。 HLA-G(humanleukocyteantigen-G，人類白細(xì)胞抗原-G)屬于

2、非經(jīng)典HLA-Ⅰ類分子，表達(dá)于母胎界面滋養(yǎng)層細(xì)胞，參與母胎免疫耐受，是正常情況下母體不對胎兒產(chǎn)生排斥反應(yīng)的主要原因，被認(rèn)為是妊娠成功的必要條件[2]。近年的研究表明，HLA-G與器官移植、生殖及腫瘤等多種免疫反應(yīng)有關(guān)，是引起免疫耐受的一種重要因子。它能夠直接抑制CD4+T細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞凋亡、抑制NK細(xì)胞的細(xì)胞溶解作用等，進(jìn)而影響機體的免疫反應(yīng)。 目的通過構(gòu)建重組HLA-G真核表達(dá)質(zhì)粒、轉(zhuǎn)染NIH3T3小鼠成纖維細(xì)胞

3、系，觀察重組HLA-G分子對RA患者T淋巴細(xì)胞的抑制作用。目前，國內(nèi)外學(xué)者對HLA-G的研究多在妊娠、腫瘤、感染性疾病、移植排斥等領(lǐng)域以及對免疫抑制方面的基礎(chǔ)研究，對于HLA-G在RA等自身免疫性疾病的臨床作用及治療未見報道。本文將通過研究重組HLA-G分子對RA患者T淋巴細(xì)胞的抑制作用，探討重組HLA-G分子治療RA的作用機制，為HLA-G治療RA的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)，以期成為治療RA的一種有效可行的基因治療方法。 方法研究

4、采用RT-PCR方法擴增HLA-GcDNA全長片段，將HLA-G基因?qū)朐吮磉_(dá)載體pMD18-T，經(jīng)BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切，將其亞克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3.0，采用陽離子聚合體包裹所構(gòu)建的pcDNA3.0-HLA-G重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染到穩(wěn)定生長的體外培養(yǎng)的NIH3T3細(xì)胞，經(jīng)G418篩選陽性克隆，免疫組織化學(xué)方法鑒定HLA-G表達(dá)，以空質(zhì)粒、空載體及正常人的淋巴細(xì)胞作對照，最后采用ELISA法測定培養(yǎng)上清中sIL-2R的表達(dá)情

5、況，分析HLA-G分子對RA外周血T淋巴細(xì)胞的抑制作用。 結(jié)果1、HLA-G原核、真核表達(dá)載體構(gòu)建成功，其基因序列測定與NCBIGeneBank報道一致；2、HLA-G基因轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞后，在光學(xué)顯微鏡下可見細(xì)胞形態(tài)改變，由梭形逐漸變成多角形；3、轉(zhuǎn)染HLA-G、pcDNA3.0空質(zhì)粒的NIH3T3細(xì)胞在G418篩選48小時后有1-2個/cm2細(xì)胞存活，且生長相對靜止，約10天后細(xì)胞開始快速生長；4、經(jīng)免疫方法檢測可見轉(zhuǎn)染