孕期邊緣型VA缺乏對大鼠海馬突觸可塑性鈣信號通路的影響及可能機制.pdf

1、維生素A（Vitamin A，VA）是人體必需的重要微量營養(yǎng)素，維生素A缺乏（vitamin A deficiency，VAD）在世界范圍內(nèi)廣泛存在，盡管目前國內(nèi)外對VA營養(yǎng)狀況越來越重視，但VAD，尤其是容易被人們忽視的可疑亞臨床VAD或邊緣型VAD仍然廣泛存在，而孕婦和兒童又是VAD和可疑亞臨床VAD的高危人群。近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)VA營養(yǎng)與學習記憶及認知功能等有密切聯(lián)系。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)從懷孕開始的邊緣型維生素A缺乏（ma

2、rginal Vitamin A deficient group，MVAD）仔鼠，其成年期學習記憶功能明顯受損，電刺激誘發(fā)海馬CA1區(qū)長時程增強（long-term potentiation，LTP）水平降低，且強刺激后MVAD組鈣離子濃度明顯低于VAN組。
　　 海馬是與學習記憶，尤其空間學習記憶功能密切相關(guān)的重要部位，LTP是突觸可塑性的神經(jīng)電生理基礎，Ca+內(nèi)流入突觸后膜是LTP誘發(fā)的起始信號。
　　 已有的研究證

3、實與Ca2+內(nèi)流入突觸后膜相關(guān)的神經(jīng)元膜受體除N-甲基-D-天冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR）外，還包括a-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic，AMPAR）受體、酪氨酸激酶B受體（tyrosine kinase B receptor，TrkBR）及代謝型谷氨酸受體（metabot

4、ropic glutamate receptor，mGluR）等。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，孕期MVAD的仔鼠其海馬組織中視黃酸核受體alpha（RARα）及NMDAR、CaM激酶Ⅱ、CBP、Arc等鈣離子依賴性突觸可塑性信號分子的表達均出現(xiàn)降低，同時，前期研究還發(fā)現(xiàn)，NMDAR1（NR1）與RARα在海馬中存在共定位表達，提示孕期MVAD可能通過視黃酸（retinoicacid，RA）-RARα依賴的信號途徑損害大鼠海馬中突觸可塑性鈣信號

5、途徑相關(guān)分子的表達，并影響鈣離子內(nèi)流，最終損害LTP。
　　 目的：進一步探討孕期MVAD對突觸可塑性相關(guān)鈣信號途徑中AMPAR、TrKBR、mGluR的影響，以及VA在體內(nèi)的活性代謝產(chǎn)物全反式視黃酸（all-trans retinoic acid，ATRA）對上述受體在神經(jīng)元中表達的影響。最后，從電生理角度，探討ATRA對神經(jīng)元鈣離子濃度調(diào)節(jié)作用、ATRA作用于不同孕期來源的神經(jīng)元后，神經(jīng)細胞內(nèi)鈣離子濃度的變化以及ATRA導致

6、神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子變化可能機制。
　　 方法：本課題構(gòu)建MVAD孕鼠及雌性幼鼠模型，隨機分為2組：（1）正常對照組（VAN組）：母鼠8只，給予維生素A充足飼料（含視黃醇6500IU/kg），生后24h及1周處死；（2）邊緣型維生素A缺乏組：母鼠8只，給予維生素A部分缺乏飼料（VAD飼料，含視黃醇400 IU/kg），生后24h及1周處死；建立孕期MVAD大鼠模型，采用HPLC測定母鼠、新生大鼠及1周齡大鼠血清中VA濃度，RT-PC

7、R測定海馬組織中RARs及NMDAR、AMPAR、TrkBR、mGluR mRNA的含量，Western blot測定RARs及NR1蛋白的水平，以探討孕期VA營養(yǎng)對仔鼠海馬中視黃酸核受體及突觸可塑性鈣離子信號途徑相關(guān)膜受體的表達調(diào)節(jié)作用；同時，采用原代無血清神經(jīng)元培養(yǎng)方法，建立不同VA營養(yǎng)來源神經(jīng)元細胞模型，分為ATRA處理組及Control組，免疫熒光技術(shù)鑒定神經(jīng)元細胞純度，并應用該方法對神經(jīng)元中RARs、NR1表達定位。RT-PC

8、R測定海馬組織中RARs及NMDAR、AMPAR、TrkBR、mGluR mRNA的含量，Western blot測定RARs及NR1蛋白的水平，以進一步了解VA營養(yǎng)對突觸可塑性鈣信號途徑的調(diào)節(jié)是否是通過ATRA-RARα信號途徑依賴性。最后，探討孕期MVAD對突觸可塑性鈣信號途徑中鈣離子內(nèi)流的影響，采用多種分組方法以探討ATRA對神經(jīng)元鈣離子濃度的影響機制：1）不同濃度的ATRA處理組：0.5μM、1μM、5μM、10μM、20μM；

9、2）ATRA作用時間分組：8min、30min、1h、24h；3）建立不同孕期VA營養(yǎng)神經(jīng)元細胞模型：MVAD及VAN，觀察神經(jīng)元細胞內(nèi)鈣離子濃度的變化；4）依據(jù)神經(jīng)元在體外不同生長時間點分組：1d、4d、8d、11d、15d，了解ATRA對神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子濃度的調(diào)節(jié)與神經(jīng)元的體外生長時間關(guān)系；5）通過細胞外液無鈣與含鈣分組，以探討ATRA導致神經(jīng)元鈣離子濃度升高的方式：外鈣內(nèi)流或是胞內(nèi)鈣釋放；6）分別采用RARα、AMPAR及NMDA

10、R拮抗劑預處理神經(jīng)元1h后，再以ATRA作用神經(jīng)元，探討這些受體在ATRA導致神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子濃度升高中作用。
　　 結(jié)果：1）MVAD組海馬組織中RARα、NR1、AMPR1、TrkBR mRNA的表達明顯低于VAN組，RARα及NR1在海馬中蛋白水平也明顯低于VAN組，而視黃酸核受體β（RARp）的表達很低；2）原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元中神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron-specific enolage，NSE）陽性細胞達到90

11、％以上，且MVAD組與VAN組比較，兩組NSE陽性細胞率無明顯差異；3）原代培養(yǎng)8天海馬神經(jīng)元中RARα及NR1明顯表達，RARα主要表達于胞漿及突起位置，少部分在細胞核，NR1則分布于胞漿及突起位置，而RARβ則表達很低；4）ATRA處理后，原代神經(jīng)元中，RARα及NR1蛋白表達上調(diào)，AMPAR及TrkBR mRNA表達上調(diào)；5）ATRA處理后，原代海馬神經(jīng)元中鈣離子濃度明顯升高，不同濃度ATRA處理后，各組鈣離子濃度變化有明顯區(qū)別；

12、ATRA作用不同時間后，神經(jīng)元鈣離子濃度變化不同；在ATRA作用于體外不同生長時間的神經(jīng)元后，其鈣離子濃度變化有顯著差異；進一步研究顯示ATRA及NMDA.分別作用于不同孕期VA營養(yǎng)神經(jīng)元時，MAVD組鈣離子升高值明顯低于VAN組；6）RARα選擇性拮抗劑、NMDAR拮抗劑MK801及AMPAR拮抗劑NBQX提前作用神經(jīng)元后，再以ATRA處理時，鈣離子濃度低于ATRA單獨作用組。
　　 結(jié)論：1.孕期MVAD降低新生大鼠及1周齡

13、大鼠海馬組織中RARα及NR1mRNA及蛋白水平的表達，ATRA能升高神經(jīng)元中RARα及NR1mRNA及蛋白水平表達，提示VA能通過RA-RARα信號通路調(diào)節(jié)NMDAR表達，電生理結(jié)果提示孕期MVAD抑制ATRA及NMDA誘導的神經(jīng)元鈣離子內(nèi)流，表明孕期MVAD能通過RA-RARα信號通路調(diào)節(jié)NMDAR表達，進而影響神經(jīng)元鈣離子內(nèi)流，這可能是VA營養(yǎng)影響突觸可塑性鈣信號通路的重要機制之一。
　　 2.孕期MVAD對新生大鼠及1周

14、齡大鼠海馬組織AMPAR、TrkBRmRNA表達降低，ATRA能升高神經(jīng)元中AMPAR及TrkBRmRNA的表達，提示VA能通過RA信號通路調(diào)節(jié)上述受體表達，這可能是VA營養(yǎng)影響突觸可塑性鈣信號通路的另一重要機制。
　　 3.ATRA會導致神經(jīng)元中鈣離子濃度的內(nèi)流，而RARα選擇性拮抗劑、NMDAR及AMPAR的拮抗劑能分別部分阻斷ATRA的作用，提示RARα、NMDAR及AMPAR在ATRA導致神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子濃度中發(fā)揮重要作