不同劑量、時(shí)間及模式的鉛暴露對(duì)SD大鼠海馬三突觸回路的突觸可塑性影響.pdf

1、研究目的：
　　環(huán)境鉛（Lead，Pb）污染所致健康損害一直是全球公共衛(wèi)生關(guān)注重點(diǎn)之一，尤其是對(duì)學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知功能的損害。大腦海馬是學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，突觸可塑性是學(xué)習(xí)記憶、認(rèn)知的生物學(xué)基礎(chǔ)。為此本研究通過(guò)建立不同劑量、不同時(shí)間段以及不同模式的大鼠鉛暴露模型，探討鉛對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的變化與大腦海馬突觸回路樹(shù)突棘形態(tài)學(xué)變化和突觸后致密質(zhì)AMPA受體數(shù)量變化之間的關(guān)系，為闡明突觸可塑性改變?cè)阢U暴露學(xué)習(xí)記憶、認(rèn)知能力損傷過(guò)程

2、中作用提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)。
　　研究方法：
　　9周性成熟雌雄性SD大鼠按2:1交配合籠后，將受孕成功的雌性大鼠隨機(jī)分至空白對(duì)照組（僅飲去離子水）、500 mg/L醋酸鉛和2000 mg/L醋酸鉛暴露組（分別相當(dāng)于319和1275 mg/L Pb2+），醋酸鉛以飲水方式暴露，直至仔鼠斷乳，即出生后3周（Postnatal week3, PNW3）。將雄性仔鼠對(duì)應(yīng)母鼠的組別，分為空白對(duì)照組（Control），低鉛暴露組（Low

3、 lead exposure group, LLG）和高鉛暴露組（High lead exposure group, HLG），分別飲用0 mg/L，100 mg/L和500 mg/L醋酸鉛水溶液（LLG和HLG相當(dāng)于64 mg/L和319 mg/L的Pb2+）。此外，另設(shè)一組為高空鉛暴露組（High to control lead exposure group, HCLG）即將飲用2000 mg/L醋酸鉛水溶液母鼠對(duì)應(yīng)的雄性仔鼠斷乳后

4、不再進(jìn)行鉛暴露繼續(xù)正常飼養(yǎng)，與其他三組同樣飼養(yǎng)至出生后52周（postnatal week52, PNW52）。分別在出生后3周（PNW3）、出生后52周（PNW52）時(shí)，使用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（ICP-OES）檢測(cè)血鉛、海馬及皮層鉛含量；使用Morris水迷宮系統(tǒng)檢測(cè)大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力；通過(guò)高爾基染色方法（Golgi-Cox）觀察海馬CA1、CA3、DG區(qū)和內(nèi)嗅皮層神經(jīng)元樹(shù)突棘的數(shù)量及形態(tài)變化；用透射電子顯微鏡觀察海馬 CA1

5、區(qū)突觸的數(shù)量及形態(tài)改變；采用激光共聚焦和免疫熒光雙標(biāo)PSD-95和GluR1蛋白檢測(cè)其表達(dá)水平及PSD-95和GluR1蛋白的共定位情況。
　　研究結(jié)果：
　　1、不同劑量、時(shí)間及模式鉛暴露對(duì)大鼠血液、海馬和皮層組織鉛含量的影響：ICP-OES檢測(cè)表明，在PNW3和PNW52的大鼠中，血鉛濃度、海馬和皮層組織鉛含量均隨著鉛暴露濃度和時(shí)間增加而增加，且呈現(xiàn)一定的劑量反應(yīng)關(guān)系（P<0.01）；除空白對(duì)照組均未檢測(cè)出外，血、皮層和

6、海馬中的鉛含量隨著年齡的增長(zhǎng)有上升的趨勢(shì)（P<0.01）；高空鉛暴露組的血液、皮層和海馬中鉛含量均低于檢出限值，基本上與空白對(duì)照組相同。
　　2、不同劑量、時(shí)間及模式鉛暴露對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響：在PNW3和PNW52的大鼠中，Morris水迷宮定位航行試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，各組大鼠在訓(xùn)練自第4天開(kāi)始，各劑量鉛暴露組的平均逃避潛伏期與空白對(duì)照組相比，出現(xiàn)不同程度的延長(zhǎng)（ P<0.05）。且空間探索試驗(yàn)中，各劑量鉛暴露組的穿越平臺(tái)次數(shù)減少（

7、P<0.05）；PNW52大鼠平臺(tái)尋找潛伏期時(shí)間和穿越平臺(tái)次數(shù)與PNW3大鼠比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；高空鉛暴露組大鼠與高鉛暴露組比較，尋找平臺(tái)的逃避潛伏期時(shí)間有所減少，但是，依舊高于空白對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而穿越平臺(tái)次數(shù)沒(méi)有明顯改善，仍然低于空白對(duì)照組（P<0.05）。
　　3、不同劑量、時(shí)間及模式鉛暴露影響大鼠海馬突觸回路的樹(shù)突棘結(jié)構(gòu)可塑性：Golgi-Cox染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在PNW3和PNW52大鼠中，鉛暴露

8、大鼠海馬三突觸回路各區(qū)（EC、DG、CA3、CA1）的樹(shù)突棘密度均隨著鉛暴露濃度增加呈現(xiàn)劑量反應(yīng)性下降（P<0.05）。鉛暴露導(dǎo)致各年齡段大鼠海馬三突觸回路絲狀偽足樹(shù)突棘比例下降以及海馬CA1和DG細(xì)長(zhǎng)型樹(shù)突棘比例下降，同時(shí)，鉛暴露引起PNW3大鼠CA1、DG和EC以及PNW52大鼠CA1和CA3區(qū)蘑菇型樹(shù)突棘比例下降。此外，鉛暴露引起在除 PNW52大鼠 CA3區(qū)外的各年齡段海馬突觸回路粗短型樹(shù)突棘比例上升（P<0.05）；空白對(duì)照組

9、大鼠在PNW52時(shí)較PNW3時(shí)的樹(shù)突棘密度大（P<0.05），而PNW52鉛暴露組大鼠DG區(qū)樹(shù)突棘密度基本上與PNW3時(shí)期一致?？瞻讓?duì)照組海馬突觸回路各區(qū)在PNW52時(shí)較PNW3時(shí)的偽足絲樹(shù)突棘百分比明顯減少，且鉛暴露劑量組在 PNW52時(shí)較 PNW3時(shí)的偽足絲樹(shù)突棘百分比明顯減少（P＜0.01）。而除了 CA3區(qū)以外，其他區(qū)的細(xì)長(zhǎng)型樹(shù)突棘在不同時(shí)間之間的變化趨勢(shì)與偽足絲樹(shù)突棘變化趨勢(shì)相反；高空鉛暴露組大鼠與高鉛暴露組比較，除了DG區(qū)樹(shù)

10、突棘密度有所改善以外，其他各區(qū)兩組之間的差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。而且，與空白對(duì)照組比較，樹(shù)突棘密度依舊是明顯減少（P＜0.05）。高空鉛暴露組大鼠海馬突觸回路的各區(qū)中與絲狀偽足樹(shù)突棘比例較空白對(duì)照組出現(xiàn)下降，而與高鉛暴露組相比無(wú)變化，高空鉛暴露組大鼠海馬CA1和DG區(qū)細(xì)長(zhǎng)型樹(shù)突棘比例出現(xiàn)較空白對(duì)照組下降而與高鉛暴露組相比無(wú)變化，且高空鉛暴露組大鼠海馬突觸回路 CA1、CA3和內(nèi)嗅皮層區(qū)中蘑菇型樹(shù)突棘比例較空白對(duì)照組下降而與高

11、鉛暴露組相比無(wú)變化，而高空鉛暴露組大鼠海馬CA1、CA3和DG區(qū)中粗短型樹(shù)突棘比例出現(xiàn)較空白對(duì)照組上升而與高鉛暴露組相比無(wú)變化。
　　4、不同劑量、時(shí)間及模式鉛暴露影響大鼠突觸結(jié)構(gòu)可塑性：電鏡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，鉛暴露引起PNW3大鼠海馬突觸數(shù)量減少、突觸后致密質(zhì)PSD厚度變薄，以及PNW52大鼠海馬突觸數(shù)量減少、突觸間隙寬度增寬和突觸界面曲率下降（P<0.05）；隨著年齡的增加，PSD厚度變薄，突觸間隙變窄，在PNW52的低鉛暴露組與相對(duì)

12、應(yīng)的 PNW3比較 PSD厚度減少（P<0.01）。突觸數(shù)量、突觸界面曲率沒(méi)有呈現(xiàn)時(shí)間的變化，高鉛暴露組突觸數(shù)量在 PNW52時(shí)期明顯低于PNW3；高空鉛暴露組與高鉛暴露組相比，突觸數(shù)量、PSD厚度、突觸間隙、突觸活性帶長(zhǎng)度以及突觸界面曲率的損傷效應(yīng)均有所改善，但是，除了突觸數(shù)量增加具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異以外（P<0.05），其他差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　5、不同劑量、時(shí)間及模式鉛暴露影響大鼠海馬突觸回路的突觸功能可塑性：免疫熒光雙染發(fā)

13、現(xiàn)，鉛暴露引起PNW3大鼠CA1區(qū)和PNW52大鼠EC區(qū)PSD95表達(dá)降低（P<0.05）。GluR1表達(dá)在PNW52大鼠的CA3和PNW3大鼠的除CA1區(qū)外海馬三突觸回路的各區(qū)出現(xiàn)鉛暴露后下降（P<0.05）。除EC區(qū)外，鉛暴露組 PNW3大鼠的其他各區(qū)的 PSD-95-GluR1的共定位點(diǎn)較空白對(duì)照組增加（P<0.05）；PSD95的表達(dá)量在PNW52大鼠空白對(duì)照組和低鉛暴露組CA1區(qū)以及高鉛暴露組的 DG和 EC區(qū)與相對(duì)應(yīng)的 PN

14、W3比較也出現(xiàn)下降（P<0.05）。GluR1表達(dá)在PNW52大鼠空白對(duì)照組CA3區(qū)、低鉛暴露組所有突觸回路區(qū)域和高鉛暴露組除 CA3區(qū)外的其他區(qū)域與相對(duì)應(yīng)的 PNW3比較也出現(xiàn)下降（P<0.05）。PSD-95-GluR1的共定位點(diǎn)在PNW52大鼠空白對(duì)照組所有突觸回路區(qū)域和高鉛暴露組DG區(qū)與相對(duì)應(yīng)的PNW3比較也出現(xiàn)增加，而高鉛暴露組CA3區(qū)出現(xiàn)下降（P<0.05）；高空鉛暴露組大鼠與空白對(duì)照組比較，僅發(fā)現(xiàn)EC區(qū)的PSD95表達(dá)下降

15、和CA3區(qū)的GluR1表達(dá)增加。高空鉛暴露組大鼠與空白對(duì)照組比較，海馬 CA3區(qū)出現(xiàn) PSD-95-GluR1的共定位點(diǎn)增加，高空鉛暴露組與高鉛暴露組相比，PSD-95-GluR1的共定位點(diǎn)在海馬CA1和DG區(qū)出現(xiàn)減少，而在EC區(qū)出現(xiàn)增加。
　　結(jié)論:
　　1、本研究通過(guò)建立不同劑量、不同時(shí)間及不同模式的鉛暴露大鼠神經(jīng)損傷模型，觀察到鉛暴露導(dǎo)致大鼠學(xué)習(xí)記憶能力損傷具有劑量依賴性，且發(fā)育早期鉛暴露，斷乳后不再鉛暴露時(shí)，其神經(jīng)系