整合素β1促進(jìn)GIT1表達(dá)而影響軟骨細(xì)胞增殖凋亡的研究.pdf

1、研究背景:
　　骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種目前普遍流行的給人類健康造成嚴(yán)重傷害的慢性退行性疾病，主要的表現(xiàn)特征為滑膜炎和軟骨下骨的重建。近年來(lái)，全世界人口一直在急劇增加，人口老齡化的問(wèn)題越來(lái)越突出，同時(shí)肥胖人口也在不斷上升，因此OA的發(fā)病率也在年年攀升。關(guān)節(jié)軟骨是透明軟骨中的一種，無(wú)血管、淋巴引流及神經(jīng)分布，其主要的組成成分為軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)。其中關(guān)節(jié)軟骨中的唯一細(xì)胞——軟骨細(xì)胞，參與合成和調(diào)節(jié)ECM

2、，在OA中起著非常重要的作用。大量研究表明，抑制軟骨細(xì)胞凋亡和促進(jìn)其增殖，可能是防控骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病過(guò)程中的關(guān)鍵一環(huán)。大量研究表明，激素、藥物、各種細(xì)胞和調(diào)節(jié)因子均能調(diào)控軟骨細(xì)胞的分泌和合成。細(xì)胞外基質(zhì)（主要包括蛋白聚糖和膠原蛋白）對(duì)軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)、分布、連接及修復(fù)有著重要的調(diào)節(jié)作用。膠原蛋白可以增強(qiáng)軟骨組織的抗拉能力，而蛋白聚糖則可以維持ECM中的水分子，助其分散軟骨組織的負(fù)荷和防御外來(lái)壓力。整合素是一種具有重要作用的表面粘附受體，其主要

3、功能是介導(dǎo)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)之間的關(guān)聯(lián)粘附，參與調(diào)節(jié)眾多細(xì)胞的各種生理過(guò)程，包括增殖、生長(zhǎng)、分化、粘附、和凋亡等。軟骨細(xì)胞中可見(jiàn)不同種類的整合素表達(dá)，而骨骼系統(tǒng)的主要表達(dá)種類是β鏈。整合素在軟骨細(xì)胞中，通過(guò)調(diào)節(jié)和激活下游蛋白受體而進(jìn)行力學(xué)信號(hào)傳導(dǎo)，從而對(duì)軟骨細(xì)胞的分化、增殖和凋亡進(jìn)行調(diào)節(jié)。在軟骨細(xì)胞中，整合素能夠傳導(dǎo)機(jī)械力刺激以及軟骨細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)，來(lái)調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的基因表達(dá)及功能。軟骨細(xì)胞中的整合素和四周的ECM相互作用，這種作用可能和細(xì)胞

4、ECM的再生、軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)分化有關(guān)。生理?xiàng)l件下，軟骨組織的合成和分解維持著動(dòng)態(tài)平衡，而對(duì)骨關(guān)節(jié)炎中關(guān)節(jié)軟骨的實(shí)驗(yàn)性研究結(jié)果指出，OA的發(fā)病主要是因?yàn)檐浌墙M織的合成與降解之間的平衡關(guān)系被破壞。與此同時(shí)，目前研究表明GIT1與整合素之間存在一定的作用關(guān)系。GIT1可與多種細(xì)胞因子和細(xì)胞表面蛋白互相作用，從而在細(xì)胞的生長(zhǎng)遷移中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。目前，GIT1在骨細(xì)胞中的研究已有一定進(jìn)展，研究比較多的是破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞，兩種細(xì)胞都能表達(dá)GI

5、T1。在成骨細(xì)胞中GIT1具有調(diào)控細(xì)胞遷移的作用，從而對(duì)骨愈合具有調(diào)控作用。目前研究均證明GIT1蛋白在骨生長(zhǎng)發(fā)育中具有重要作用，可以對(duì)細(xì)胞骨架進(jìn)行調(diào)控而發(fā)揮其功能，并且自身也是一種支架蛋白，從而進(jìn)行各種信號(hào)傳導(dǎo)。但是到目前為止，GIT1對(duì)軟骨細(xì)胞的作用研究還很少，且整合素β1和GIT1之間的調(diào)控關(guān)系尚未明確，有研究指出，GIT1可能是整合素傳導(dǎo)控制通路下游的一個(gè)重要蛋白分子。
　　研究目的:
　　因此本研究通過(guò)建立骨關(guān)節(jié)炎

6、模型，主要探討整合素β1和GIT1對(duì)軟骨細(xì)胞的影響，及二者之間的調(diào)控關(guān)系。以便對(duì)臨床上骨性關(guān)節(jié)炎的治療起指導(dǎo)作用。
　　研究方法:
　　1、本次研究，我們采用約一周齡的年乳大鼠20只，雌雄不限。用Hulth法建立骨關(guān)節(jié)炎模型，進(jìn)行關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的分離獲取，一步消化法(Ⅱ型膠原酶)處理骨關(guān)節(jié)炎大鼠的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，分離軟骨細(xì)胞后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。采用Trizol法提取關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞總RNA，并采用PCR技術(shù)擴(kuò)增integrin-β1和G

7、IT1編碼區(qū)，用KpnⅠ、EcoRⅠ雙酶切克隆到pcDNA3.1載體上。然后通過(guò)RNAi實(shí)驗(yàn)抑制integrin-β1的表達(dá)。分別采用定量PCR和Western Blotting檢測(cè)對(duì)照組、pcDNA3.1空載體轉(zhuǎn)染組、pcDNA3.1-GIT1過(guò)表達(dá)組、pcDNA3.1-integrin-β1過(guò)表達(dá)組、integrin-β1 siRNA組和NC siRNA組中，integrin-β1和GIT1的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，來(lái)判斷int

8、egrin-β1和GIT1之間的調(diào)控關(guān)系。
　　2、取第一代的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)，分別采用定量PCR和WesternBlotting檢測(cè)對(duì)照組、pcDNA3.1空載體轉(zhuǎn)染組、pcDNA3.1-GIT1過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染組、pcDNA3.1-integrin-β1過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染組、integrin-β1 siRNA轉(zhuǎn)染組和NCsiRNA轉(zhuǎn)染組中Ⅱ型膠原蛋白和蛋白多糖的表達(dá)。分別采用BrdU法和TUNEL-DAPI檢測(cè)軟骨細(xì)胞的增

9、殖和凋亡現(xiàn)象。
　　研究結(jié)果:
　　1、熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)染integrinβ1-siRNA后，敲除integrinβ1的表達(dá)時(shí)，GIT1 mRNA的表達(dá)水平相應(yīng)下降，而過(guò)表達(dá)integrinβ1時(shí)，GIT1 mRNA的表達(dá)水平顯著上調(diào)，與對(duì)照組進(jìn)行比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異意義(P＜0.05);然而提高GIT1的表達(dá)后，integrinβ1 mRNA的表達(dá)水平不受影響。采用蛋白免疫印跡法檢測(cè)后，蛋白表達(dá)水平和基因表達(dá)水平

10、相似。敲除integrinβ1后，GIT1的蛋白表達(dá)水平隨之降低，提高integrinβ1的表達(dá)時(shí)，GIT1的蛋白表達(dá)水平上調(diào)顯著，與對(duì)照組進(jìn)行比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異意義(P＜0.05)。而GIT1過(guò)表達(dá)時(shí)，integrinβ1蛋白水平不會(huì)受到干擾。
　　2、對(duì)軟骨細(xì)胞采用integrin-β1 siRNA和NC siRNA轉(zhuǎn)染，培育48個(gè)小時(shí)后，用Brdu法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組、pcDNA3.1組、pcDNA3.1-GIT1組、pcD

11、NA3.1-integrin-β1組、integrin-β1 siRNA組和NC siRNA組之間，骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的增值率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。integrin-β1和GIT1的過(guò)表達(dá)可以提高軟骨細(xì)胞的增值率。
　　用熒光定量PCR和蛋白免疫印跡檢測(cè)技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，Aggrecan、typeⅡCollagen的mRNA和蛋白表達(dá)水平在pcDNA3.1-GIT1組、pcDNA3.1-integrin-β1組最高，抑制in

12、tegrin-β1的表達(dá)后，二者的蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。采用TUNEL-DAPI分析法檢測(cè)DNA斷裂情況，從而確定軟骨細(xì)胞凋亡的高低。結(jié)果顯示，integrin-β1的過(guò)表達(dá)明顯抑制了軟骨細(xì)胞的凋亡，而當(dāng)抑制integrin-β1的表達(dá)時(shí)，并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)對(duì)軟骨細(xì)胞的凋亡有明顯的影響。
　　研究結(jié)論:
　　在體外骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞模型中發(fā)現(xiàn)，integrin-β1和GIT1均能促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖