整合素β1對(duì)人表皮干細(xì)胞增殖與分化的影響.pdf

1、表皮干細(xì)胞(keratinocytestemcell，KSC)位于表皮基底層，具有強(qiáng)大的增殖潛能，可分化形成全層表皮，并具有產(chǎn)生皮膚附件的作用，是潛在的多能干細(xì)胞。由于表皮干細(xì)胞數(shù)量少，而且體外培養(yǎng)很容易分化，所以對(duì)培養(yǎng)KSC的生物學(xué)特性進(jìn)行深入研究具有重要的意義。探究如何在體外培養(yǎng)獲得足夠數(shù)量的KSC用于研究及移植、如何在體內(nèi)外誘導(dǎo)KSC定向分化是KSC研究的又一重要課題，解決這些問(wèn)題的關(guān)鍵在于研究KSC增殖與分化的調(diào)控機(jī)制。

2、 本室先期已對(duì)不同來(lái)源皮膚中的KSC的定位分布進(jìn)行了研究，對(duì)KSC進(jìn)行了初步的分離培養(yǎng)。本研究主要探討分離純化人KSC的方法，觀察KSC在體外培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)及分化特性。針對(duì)目的基因整合素β1(integrinβ1)構(gòu)建siRNA表達(dá)質(zhì)粒并鑒定，探討下調(diào)KSC中整合素β1的表達(dá)對(duì)KSC增殖與分化的影響。 將人表皮細(xì)胞接種在Ⅳ型膠原包被的培養(yǎng)瓶中粘附10min，取粘附的類KSC以低密度接種于滋養(yǎng)層上，培養(yǎng)14d后挑選KSC克隆分散

3、培養(yǎng)，觀察其克隆再形成率，通過(guò)免疫細(xì)胞熒光染色法檢測(cè)培養(yǎng)KSC中interginβ1及involucrin的表達(dá)水平，分析其細(xì)胞周期。將一個(gè)KSC克隆的所有子代細(xì)胞消化后接種，連續(xù)傳代，培養(yǎng)14d后計(jì)算克隆形成率(CFE)，觀察KSC子代細(xì)胞的總體分化情況。 針對(duì)目的基因integrinβ1選擇了兩個(gè)RNAi作用靶點(diǎn)，構(gòu)建到pSilencer3.1/H1-Hygro載體上，通過(guò)酶切及測(cè)序鑒定重組陽(yáng)性質(zhì)粒。將低密度接種的KSC克隆

4、挑選出來(lái)分散后接種，待細(xì)胞長(zhǎng)至60％左右匯合時(shí)轉(zhuǎn)染，用不同比例脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Dotap介導(dǎo)轉(zhuǎn)染不同劑量報(bào)告基因EGFP，優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。重組陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人KSC，通過(guò)定量westernblot、半定量RT-PCR檢測(cè)對(duì)目的基因的抑制效率，篩選出最有效的RNAi作用靶點(diǎn)，將其重組質(zhì)粒命名為siIntegrinβ1。 重組質(zhì)粒siIntegrinβ1轉(zhuǎn)染人KSC48～72h后，提取細(xì)胞總蛋白及總RNA，通過(guò)定量westernblot、

5、半定量RT-PCR檢測(cè)對(duì)目的基因的抑制效率；并對(duì)RNAi后KSC行細(xì)胞周期分析。挑選RNAi后48～72h的KSC克隆分散后接種于滋養(yǎng)層上，培養(yǎng)14d后用1％羅丹藍(lán)染色計(jì)算CFE，觀察下調(diào)integrinβ1的表達(dá)對(duì)KSC增殖與分化的影響，并設(shè)有效的對(duì)照組(非轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染pSilencer3.1/H1組、轉(zhuǎn)染siNegative組)。 研究發(fā)現(xiàn)，利用Ⅳ型膠原快速粘附法富集KSC，結(jié)合低密度單克隆挑選可以提高KSC篩選效率及純度。

6、KSC在培養(yǎng)過(guò)程中可見三種克隆形態(tài)共存的現(xiàn)象：即全克隆(holoclone)、短暫增殖克隆(meroclone)、終末克隆(paraclone)。只有全克隆可以連續(xù)傳代，并進(jìn)一步增殖分化出所有三種類型的克隆，其他克隆不能傳代培養(yǎng)。KSC克隆的子代細(xì)胞在體外培養(yǎng)會(huì)逐漸發(fā)生分化，但仍保留一定比例的干細(xì)胞數(shù)。 載體介導(dǎo)的RNAi技術(shù)能夠下調(diào)KSC中integrinβ1的表達(dá)。針對(duì)靶基因integrinβ1設(shè)計(jì)和構(gòu)建了兩個(gè)重組質(zhì)粒siI

7、ntegrinβ1-1和siIntegrinβ1-2，并轉(zhuǎn)染人KSC，能夠不同程度的下調(diào)integrinβ1的蛋白表達(dá)，其中靶點(diǎn)二的抑制效率高于靶點(diǎn)一，抑制效率達(dá)到了60～70％。提示H1啟動(dòng)子介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)合成siRNA策略，能夠成功地在KSC中應(yīng)用，為進(jìn)一步研究integrinβ1在KSC中的功能奠定了基礎(chǔ)。 RNAi技術(shù)干擾整合素β1基因表達(dá)可促進(jìn)KSC分化。挑取RNAi后48～72h的KSC克隆，培養(yǎng)14d后計(jì)算克隆再形成