胰島素樣生長因子-1對模擬失重下成骨細胞整合素亞單位表達的影響.pdf

1、[研究背景]
　　 骨質疏松癥主要特征是骨量減少，骨的微觀結構退化:骨小梁變細、斷裂、數(shù)量減少;皮質骨多孔變薄等。主要臨床表現(xiàn)為骨強度下降、脆性增加以及易于發(fā)生骨折的一種全身性疾病。骨質疏松癥分為原發(fā)性骨質疏松和繼發(fā)性骨質疏松，絕經后骨質疏松、老年性骨質疏松等屬于原發(fā)性骨質疏松。而失重性骨質疏松是繼發(fā)性骨質疏松的一種，目前認為它是由航天失重環(huán)境引起的一種特殊的廢用性骨質疏松，隨著航天事業(yè)的蓬勃發(fā)展，它已嚴重的阻礙了人類探索太空的

2、腳步。目前空間飛行采取的運動鍛煉、藥物預防和營養(yǎng)補充都不能有效防止骨丟失的發(fā)生發(fā)展;為了確保航天員在未來長期飛行任務中健康、高效工作，需要在細胞分子水平闡明空間骨丟失的發(fā)生機制;發(fā)展基于細胞分子本質認識的有效對抗防護措施。在航天飛行中宇航員們處于一個完全失重的狀態(tài)，表現(xiàn)為只有質量而沒有重量，我們把這種特殊的力學環(huán)境叫做微重力。物體處于微重力環(huán)境中時，受到的非引力的力一般都很小，產生的加速度也很小。這種非引力加速度通常只有地面重力加速度的

3、萬分之一或更小，其大小通常不超過10-5～1(0)-4g。為了與正常的重力對比，就把這種微加速度現(xiàn)象叫做“微重力”，微重力越小，失重越完全。失重狀態(tài)只是理想狀態(tài)，微重力才是實際情況。失重性骨質疏松就是以力學刺激作用了骨組織導致的骨質疏松。研究發(fā)現(xiàn)失重性骨質疏松的骨量丟失的原因主要為骨形成的降低，而骨吸收并沒有明顯的上升。而成骨細胞的主要作用是感受力學刺激，進而發(fā)揮成骨作用，是維持骨量的主要細胞。在失重時成骨細胞的失去正常的代謝規(guī)律，他的

4、增殖、分化的功能以及細胞內細胞骨架的聚合與解聚均受到了抑制，這種成骨細胞的數(shù)量的變化以及代謝的紊亂就更進一步的降低了成骨細胞的成骨能力，導致骨形成的減少。目前對失重條件下，成骨細胞感受和傳導力學刺激的細胞骨架、細胞信號轉導及基因表達等發(fā)生的變化都取得了一定的進展。目前研究表明胰島素樣生長因子(Ⅰ)(IGF-1)的水平與骨質疏松的的發(fā)生有密切聯(lián)系，胰島素樣生長因子-1(IGF-1)是成骨細胞分化調控的重要生長因子，它能減少骨膠原退化、增加

5、骨質沉積、促進成骨細胞分化成熟，其水平與骨密度相關。在骨質疏松的病人中發(fā)現(xiàn)血清IGF-1水平降低，而在失重條件下IGF-1信號級聯(lián)受到抑制。整合素是細胞跨膜分子中的重要一種，細胞通過整合素與聚焦粘附激酶、胞外基質蛋白、細胞骨架蛋白等的相互作用，將感應的力信號轉化為化學信號，參與細胞各種生理功能的調節(jié)，在機械信號轉導中發(fā)揮重要作用。在模擬失重的條件下，成骨細胞整合素亞單位的表達是下降的。
　　 胰島素樣生長因子系統(tǒng)(IGFS)包括

6、IGF1和IGF2，兩個IGF受體，六個IGF結合蛋白(IGFBP(1)—6)，IGFBP蛋白酶。IGFS與成骨細胞和破骨細胞的功能及其成骨破骨偶聯(lián)有著密切關系。IGF-1是IGFS的重要組成部分。IGF-1是長骨生長的一種必需因子，在干骺端，它刺激軟骨細胞的增殖分化，在皮質及松質骨的形成過程中發(fā)揮作用，刺激成骨細胞的增殖和分化，增加(Ⅰ)型膠原的合成，堿性磷酸酶的活性以及骨鈣素的產生。抑制由成骨細胞產生的膠原降解，還對無機鹽及腎臟1，

7、25(OH)2D3合成產生作用。IGF-1被認為是腸道吸收及細胞外鈣和磷的重要調控劑。最新的研究結果表明，絕經婦女的血中IGF-1含量較成年人低30％～40％，由此可見IGF-1與年齡呈負相關。在青春期前，IGF-1缺乏或呈抵抗可延緩長骨生長及峰值骨量的減低。用雙能x線骨密度儀測定去卵巢大鼠的骨質疏松模型的椎、脛骨及脛骨遠端骨礦物質密度(BMD)。然后將一種特殊的可持續(xù)釋放IGF-1的裝置放入大鼠皮下6周，結果發(fā)現(xiàn)實驗所測3個位點的BM

8、D均有一定程度的增加，且呈劑量依賴性。該動物模型由IGF-1引起的BMD的增加，主要是通過骨干增粗來實現(xiàn)的。成骨細胞除具有IGF-1受體外，也具有產生1GF-1的機能。因此IGF-1與骨代謝有著重要的關系。
　　 整合素是存在于細胞表面的一種重要跨膜分子，細胞感應細胞外基質中的各種刺激（包括物理，化學等）后，胞外基質蛋白將這種刺激傳遞給細胞表面的整合素，整合素再通過與細胞骨架蛋白以及細胞內各種酶的反應，將感應到的各種刺激轉化為化

9、學信號，從而調節(jié)細胞的生理機能，機械信號轉導的實現(xiàn)很大程度上也是依賴這一途徑進行的。研究證實失重或模擬失重環(huán)境下骨骼的機械信號傳導途徑受到抑制，其中一條重要的途徑為細胞外基質-整合素-細胞骨架系統(tǒng)，失重情況下整合素亞單位的表達下降，表明失重可能通過抑制整合素的表達來調節(jié)下游分子的變化。
　　 研究表明IGF-1和整合素信號通路存在相互聯(lián)系，失重可能通過整合素影響IGF-1通路的作用。本實驗旨在探討失重條件下IGF-1對成骨細胞整

10、合素亞單位基因表達的影響，為失重性骨質疏松的治療提供理論和實驗依據(jù)。
　　 [目的]
　　 本研究主要從細胞分子水平探討失重導致骨質疏松的可能機制。以小鼠成骨樣細胞株(MC3T3-E1)作對象，以回轉器模擬微重力效應，探討失重條件下IGF-1對成骨細胞整合素亞單位基因表達的影響。以期進一步了解IGF-1及整合素在失重性骨質疏松發(fā)生中的相互作用，為骨質疏松的治療提供新的方法。
　　 [對象和方法]
　　 1

11、.細胞株及培養(yǎng)
　　 利用已建株的小鼠成骨樣細胞MC3T3-E1（南方醫(yī)科大學解剖實驗室提供），采用同一批凍存細胞復蘇，用低糖的DMEM培養(yǎng)基，10％胎牛血清和雙抗作常規(guī)培養(yǎng)，4d傳代，隔天換液。
　　 2.成骨細胞株活性鑒定
　　 采用茜素紅礦化結節(jié)染色法檢測體外礦化能力。
　　 3.建立模擬失重成骨細胞模型及添加干預
　　 使用旋轉細胞培養(yǎng)系統(tǒng)(RCCS)中50ml容積的高截面縱橫比容器(Hi

12、ghAspect Ratio Vessel，HARV)模擬微重力，并聯(lián)合Cephodex型微載體進行成骨細胞培養(yǎng)。當成骨細胞株復蘇后傳至第3代時，在細胞對數(shù)生長期，細胞性狀較穩(wěn)定時，更換培養(yǎng)基為無血清的低糖DMEM饑餓培養(yǎng)24h，收集細胞按3×105個細胞/ml隨機接種于預先放置微載體的5個回旋培養(yǎng)筒中，分為正常重力組，模擬失重組，模擬失重+10ng/mlIGF-1組，模擬失重+50ng/mlIGF-1組，模擬失重+100ng/mlIG

13、F-1組。正常重力組及模擬失重組灌滿無血清的低糖DMEM，其余各組分別灌滿含10ng/mlIGF-1、50ng/mlIGF-1、100ng/mlIGF-1的無血清低糖DMEM，排凈氣泡。正常重力組置于37℃、5％CO2、濕度飽和的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，其余各組置于回轉器上，前8h低速間歇回轉，每45min攪動1～2min，之后以30r/min的轉速回轉培養(yǎng)，每天觀察容器內有無氣泡產生，如發(fā)現(xiàn)氣泡，立即在在無菌條件下抽盡氣泡，培養(yǎng)48h后消化

14、收集細胞。
　　 4.提取RNA進行RT-PCR反應
　　 利用Trizol法提取總RNA進行反轉錄PCR，檢測整合素α2α5β1亞單位mRNA的表達，同時以GAPDH基因作為內參照。掃描PCR產物電泳照片，計算integrinα2/GAPDH、integrinα5/GAPDH、integrinβ1/GAPDH的積分光密度比值，推算integrina2、integrinα5、integrinβ1基因的相對表達水平。

15、>　　 5.統(tǒng)計學方法
　　 相同條件的實驗重復5次(n=5)，實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，組間比較利用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行單向方差分析(one-way ANOVA)檢測各組間差異，LSD方法進行多樣本均數(shù)兩兩比較，方差齊性采用Levene檢驗，顯著性檢驗水準α≤0.05。
　　 [結果]
　　 1.成骨細胞生長情況:MC3T3—E1細胞株經復蘇培養(yǎng)后，在相差顯微鏡下呈三角形、菱形、多邊形等不規(guī)則形狀，細胞透

16、明度好，細胞膜內未見黑色小顆粒。細胞核為較大的圓球形，內含核仁。細胞有2-3個觸突，每個細胞的觸突均向外伸展，與周圍的細胞的突起連接取來，聚集成團形成集落樣生長的趨勢。
　　 2.各組整合素亞單位表達情況:與正常重力組比較，模擬失重組的integrinα2、integrinα5、integrinβ1的mRNA表達明顯下降(P＜0.05);與模擬失重組比較，模擬失重+IGF-1組的integrinα2、integrinα5、int