胰島素樣生長因子-1對(duì)模擬失重下成骨細(xì)胞整合素亞單位表達(dá)的影響.pdf

1、[研究背景]
　　 骨質(zhì)疏松癥主要特征是骨量減少，骨的微觀結(jié)構(gòu)退化:骨小梁變細(xì)、斷裂、數(shù)量減少;皮質(zhì)骨多孔變薄等。主要臨床表現(xiàn)為骨強(qiáng)度下降、脆性增加以及易于發(fā)生骨折的一種全身性疾病。骨質(zhì)疏松癥分為原發(fā)性骨質(zhì)疏松和繼發(fā)性骨質(zhì)疏松，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松、老年性骨質(zhì)疏松等屬于原發(fā)性骨質(zhì)疏松。而失重性骨質(zhì)疏松是繼發(fā)性骨質(zhì)疏松的一種，目前認(rèn)為它是由航天失重環(huán)境引起的一種特殊的廢用性骨質(zhì)疏松，隨著航天事業(yè)的蓬勃發(fā)展，它已嚴(yán)重的阻礙了人類探索太空的

2、腳步。目前空間飛行采取的運(yùn)動(dòng)鍛煉、藥物預(yù)防和營養(yǎng)補(bǔ)充都不能有效防止骨丟失的發(fā)生發(fā)展;為了確保航天員在未來長期飛行任務(wù)中健康、高效工作，需要在細(xì)胞分子水平闡明空間骨丟失的發(fā)生機(jī)制;發(fā)展基于細(xì)胞分子本質(zhì)認(rèn)識(shí)的有效對(duì)抗防護(hù)措施。在航天飛行中宇航員們處于一個(gè)完全失重的狀態(tài)，表現(xiàn)為只有質(zhì)量而沒有重量，我們把這種特殊的力學(xué)環(huán)境叫做微重力。物體處于微重力環(huán)境中時(shí)，受到的非引力的力一般都很小，產(chǎn)生的加速度也很小。這種非引力加速度通常只有地面重力加速度的

3、萬分之一或更小，其大小通常不超過10-5～1(0)-4g。為了與正常的重力對(duì)比，就把這種微加速度現(xiàn)象叫做“微重力”，微重力越小，失重越完全。失重狀態(tài)只是理想狀態(tài)，微重力才是實(shí)際情況。失重性骨質(zhì)疏松就是以力學(xué)刺激作用了骨組織導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松。研究發(fā)現(xiàn)失重性骨質(zhì)疏松的骨量丟失的原因主要為骨形成的降低，而骨吸收并沒有明顯的上升。而成骨細(xì)胞的主要作用是感受力學(xué)刺激，進(jìn)而發(fā)揮成骨作用，是維持骨量的主要細(xì)胞。在失重時(shí)成骨細(xì)胞的失去正常的代謝規(guī)律，他的

4、增殖、分化的功能以及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞骨架的聚合與解聚均受到了抑制，這種成骨細(xì)胞的數(shù)量的變化以及代謝的紊亂就更進(jìn)一步的降低了成骨細(xì)胞的成骨能力，導(dǎo)致骨形成的減少。目前對(duì)失重條件下，成骨細(xì)胞感受和傳導(dǎo)力學(xué)刺激的細(xì)胞骨架、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及基因表達(dá)等發(fā)生的變化都取得了一定的進(jìn)展。目前研究表明胰島素樣生長因子(Ⅰ)(IGF-1)的水平與骨質(zhì)疏松的的發(fā)生有密切聯(lián)系，胰島素樣生長因子-1(IGF-1)是成骨細(xì)胞分化調(diào)控的重要生長因子，它能減少骨膠原退化、增加

5、骨質(zhì)沉積、促進(jìn)成骨細(xì)胞分化成熟，其水平與骨密度相關(guān)。在骨質(zhì)疏松的病人中發(fā)現(xiàn)血清IGF-1水平降低，而在失重條件下IGF-1信號(hào)級(jí)聯(lián)受到抑制。整合素是細(xì)胞跨膜分子中的重要一種，細(xì)胞通過整合素與聚焦粘附激酶、胞外基質(zhì)蛋白、細(xì)胞骨架蛋白等的相互作用，將感應(yīng)的力信號(hào)轉(zhuǎn)化為化學(xué)信號(hào)，參與細(xì)胞各種生理功能的調(diào)節(jié)，在機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。在模擬失重的條件下，成骨細(xì)胞整合素亞單位的表達(dá)是下降的。
　　 胰島素樣生長因子系統(tǒng)(IGFS)包括

6、IGF1和IGF2，兩個(gè)IGF受體，六個(gè)IGF結(jié)合蛋白(IGFBP(1)—6)，IGFBP蛋白酶。IGFS與成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的功能及其成骨破骨偶聯(lián)有著密切關(guān)系。IGF-1是IGFS的重要組成部分。IGF-1是長骨生長的一種必需因子，在干骺端，它刺激軟骨細(xì)胞的增殖分化，在皮質(zhì)及松質(zhì)骨的形成過程中發(fā)揮作用，刺激成骨細(xì)胞的增殖和分化，增加(Ⅰ)型膠原的合成，堿性磷酸酶的活性以及骨鈣素的產(chǎn)生。抑制由成骨細(xì)胞產(chǎn)生的膠原降解，還對(duì)無機(jī)鹽及腎臟1，

7、25(OH)2D3合成產(chǎn)生作用。IGF-1被認(rèn)為是腸道吸收及細(xì)胞外鈣和磷的重要調(diào)控劑。最新的研究結(jié)果表明，絕經(jīng)婦女的血中IGF-1含量較成年人低30％～40％，由此可見IGF-1與年齡呈負(fù)相關(guān)。在青春期前，IGF-1缺乏或呈抵抗可延緩長骨生長及峰值骨量的減低。用雙能x線骨密度儀測定去卵巢大鼠的骨質(zhì)疏松模型的椎、脛骨及脛骨遠(yuǎn)端骨礦物質(zhì)密度(BMD)。然后將一種特殊的可持續(xù)釋放IGF-1的裝置放入大鼠皮下6周，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)所測3個(gè)位點(diǎn)的BM

8、D均有一定程度的增加，且呈劑量依賴性。該動(dòng)物模型由IGF-1引起的BMD的增加，主要是通過骨干增粗來實(shí)現(xiàn)的。成骨細(xì)胞除具有IGF-1受體外，也具有產(chǎn)生1GF-1的機(jī)能。因此IGF-1與骨代謝有著重要的關(guān)系。
　　 整合素是存在于細(xì)胞表面的一種重要跨膜分子，細(xì)胞感應(yīng)細(xì)胞外基質(zhì)中的各種刺激（包括物理，化學(xué)等）后，胞外基質(zhì)蛋白將這種刺激傳遞給細(xì)胞表面的整合素，整合素再通過與細(xì)胞骨架蛋白以及細(xì)胞內(nèi)各種酶的反應(yīng)，將感應(yīng)到的各種刺激轉(zhuǎn)化為化

9、學(xué)信號(hào)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理機(jī)能，機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的實(shí)現(xiàn)很大程度上也是依賴這一途徑進(jìn)行的。研究證實(shí)失重或模擬失重環(huán)境下骨骼的機(jī)械信號(hào)傳導(dǎo)途徑受到抑制，其中一條重要的途徑為細(xì)胞外基質(zhì)-整合素-細(xì)胞骨架系統(tǒng)，失重情況下整合素亞單位的表達(dá)下降，表明失重可能通過抑制整合素的表達(dá)來調(diào)節(jié)下游分子的變化。
　　 研究表明IGF-1和整合素信號(hào)通路存在相互聯(lián)系，失重可能通過整合素影響IGF-1通路的作用。本實(shí)驗(yàn)旨在探討失重條件下IGF-1對(duì)成骨細(xì)胞整

10、合素亞單位基因表達(dá)的影響，為失重性骨質(zhì)疏松的治療提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 [目的]
　　 本研究主要從細(xì)胞分子水平探討失重導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的可能機(jī)制。以小鼠成骨樣細(xì)胞株(MC3T3-E1)作對(duì)象，以回轉(zhuǎn)器模擬微重力效應(yīng)，探討失重條件下IGF-1對(duì)成骨細(xì)胞整合素亞單位基因表達(dá)的影響。以期進(jìn)一步了解IGF-1及整合素在失重性骨質(zhì)疏松發(fā)生中的相互作用，為骨質(zhì)疏松的治療提供新的方法。
　　 [對(duì)象和方法]
　　 1

11、.細(xì)胞株及培養(yǎng)
　　 利用已建株的小鼠成骨樣細(xì)胞MC3T3-E1（南方醫(yī)科大學(xué)解剖實(shí)驗(yàn)室提供），采用同一批凍存細(xì)胞復(fù)蘇，用低糖的DMEM培養(yǎng)基，10％胎牛血清和雙抗作常規(guī)培養(yǎng)，4d傳代，隔天換液。
　　 2.成骨細(xì)胞株活性鑒定
　　 采用茜素紅礦化結(jié)節(jié)染色法檢測體外礦化能力。
　　 3.建立模擬失重成骨細(xì)胞模型及添加干預(yù)
　　 使用旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(RCCS)中50ml容積的高截面縱橫比容器(Hi

12、ghAspect Ratio Vessel，HARV)模擬微重力，并聯(lián)合Cephodex型微載體進(jìn)行成骨細(xì)胞培養(yǎng)。當(dāng)成骨細(xì)胞株復(fù)蘇后傳至第3代時(shí)，在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長期，細(xì)胞性狀較穩(wěn)定時(shí)，更換培養(yǎng)基為無血清的低糖DMEM饑餓培養(yǎng)24h，收集細(xì)胞按3×105個(gè)細(xì)胞/ml隨機(jī)接種于預(yù)先放置微載體的5個(gè)回旋培養(yǎng)筒中，分為正常重力組，模擬失重組，模擬失重+10ng/mlIGF-1組，模擬失重+50ng/mlIGF-1組，模擬失重+100ng/mlIG

13、F-1組。正常重力組及模擬失重組灌滿無血清的低糖DMEM，其余各組分別灌滿含10ng/mlIGF-1、50ng/mlIGF-1、100ng/mlIGF-1的無血清低糖DMEM，排凈氣泡。正常重力組置于37℃、5％CO2、濕度飽和的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，其余各組置于回轉(zhuǎn)器上，前8h低速間歇回轉(zhuǎn)，每45min攪動(dòng)1～2min，之后以30r/min的轉(zhuǎn)速回轉(zhuǎn)培養(yǎng)，每天觀察容器內(nèi)有無氣泡產(chǎn)生，如發(fā)現(xiàn)氣泡，立即在在無菌條件下抽盡氣泡，培養(yǎng)48h后消化

14、收集細(xì)胞。
　　 4.提取RNA進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)
　　 利用Trizol法提取總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR，檢測整合素α2α5β1亞單位mRNA的表達(dá)，同時(shí)以GAPDH基因作為內(nèi)參照。掃描PCR產(chǎn)物電泳照片，計(jì)算integrinα2/GAPDH、integrinα5/GAPDH、integrinβ1/GAPDH的積分光密度比值，推算integrina2、integrinα5、integrinβ1基因的相對(duì)表達(dá)水平。

15、>　　 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　 相同條件的實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次(n=5)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，組間比較利用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單向方差分析(one-way ANOVA)檢測各組間差異，LSD方法進(jìn)行多樣本均數(shù)兩兩比較，方差齊性采用Levene檢驗(yàn)，顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)α≤0.05。
　　 [結(jié)果]
　　 1.成骨細(xì)胞生長情況:MC3T3—E1細(xì)胞株經(jīng)復(fù)蘇培養(yǎng)后，在相差顯微鏡下呈三角形、菱形、多邊形等不規(guī)則形狀，細(xì)胞透

16、明度好，細(xì)胞膜內(nèi)未見黑色小顆粒。細(xì)胞核為較大的圓球形，內(nèi)含核仁。細(xì)胞有2-3個(gè)觸突，每個(gè)細(xì)胞的觸突均向外伸展，與周圍的細(xì)胞的突起連接取來，聚集成團(tuán)形成集落樣生長的趨勢。
　　 2.各組整合素亞單位表達(dá)情況:與正常重力組比較，模擬失重組的integrinα2、integrinα5、integrinβ1的mRNA表達(dá)明顯下降(P＜0.05);與模擬失重組比較，模擬失重+IGF-1組的integrinα2、integrinα5、int