新型抗結(jié)核先導(dǎo)化合物活性評(píng)價(jià)及其機(jī)制初探.pdf

1、結(jié)核病是全球發(fā)病率和死亡率最高的傳染性疾病之一。結(jié)核分枝桿菌（是引起結(jié)核病的病原菌。世界衛(wèi)生組織2011年的全球結(jié)核病控制調(diào)查報(bào)告表明，2011年全球約880萬新發(fā)病例（850萬-920萬），有110萬人死于結(jié)核病，并有35萬病人死于TB-HIV共感染。結(jié)核分枝桿菌持續(xù)感染及耐多藥菌株的出現(xiàn)和蔓延，是目前結(jié)核病研究面臨的兩個(gè)最大難題，故開發(fā)新型抗結(jié)核藥物迫在眉睫。
　　結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁合成途徑中的某些獨(dú)特成分和因子可以成為藥物設(shè)

2、計(jì)的潛在靶標(biāo)。結(jié)核分枝桿菌海藻糖是構(gòu)成細(xì)菌細(xì)胞壁糖脂的必要組成成分，而海藻糖磷酸磷酸酶(TPP)是海藻糖磷酸合成過程中的關(guān)鍵酶，而且由于在人和哺乳動(dòng)物體內(nèi)沒有TPP的同源蛋白，因此TPP是非常具有價(jià)值的潛在的抗結(jié)核藥物的重要靶標(biāo)。
　　本實(shí)驗(yàn)室通過前期選取結(jié)核分枝桿菌海藻糖磷酸磷酸酶作為藥物靶標(biāo)，基于虛擬篩選得到了一系列在體外能有效抑制MTB活性的先導(dǎo)化合物。本研究選取其中一個(gè)小分子化合物E對(duì)其抗結(jié)核活性進(jìn)行深入評(píng)價(jià)。檢測(cè)了化合物

3、E對(duì)結(jié)核分枝桿菌H37Ra株的最小抑菌濃度(MIC)為0.078μgml，對(duì)H37Rv株MIC為4μg/ml，對(duì)恥垢分枝桿菌MIC為12.5μg/ml，對(duì)海分枝桿菌MIC為50μg/ml，對(duì)偶然分枝桿菌MIC為32μg/ml，對(duì)鳥分枝桿菌MIC為32μg/ml，對(duì)堪薩斯分枝桿菌MIC為32μg/ml?；衔顴對(duì)結(jié)核桿菌H37Ra菌株具有殺菌活性，最小殺菌濃度(MBC)為4MIC。相比培養(yǎng)六周的H37Ra，化合物E對(duì)生長(zhǎng)活躍期的H37Ra

4、有較好的殺菌作用。1MBC化合物E濃度作用于H37Ra菌株，第8天殺菌率可達(dá)100％。結(jié)核桿菌H37Ra菌株在化合物E亞抑制濃度(0.02ug/ml)作用下，生長(zhǎng)曲線發(fā)生了明顯的變化。與治療結(jié)核一線藥物異煙肼(INH)、利福平(RIF)協(xié)間作用實(shí)驗(yàn)表明化合物E與INH及RIF分別具有相加及協(xié)同作用?；衔顴對(duì)THP-1細(xì)胞具有較低的細(xì)胞毒性，對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)的結(jié)核桿菌也具有一定的殺菌活性。化合物E對(duì)處于持留狀態(tài)的結(jié)核分枝桿菌也具有一定的殺菌

5、作用。且結(jié)核分枝桿菌對(duì)化合物E不易發(fā)生耐藥。這些結(jié)果表明了化合物E具有良好的體外抗結(jié)核活性，為研發(fā)新型抗結(jié)核藥物打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　同時(shí)為了驗(yàn)證前期海藻糖磷酸磷酸酶作為小分子化合物E作用靶點(diǎn)的假設(shè)，在本研究中表達(dá)并純化了TPP蛋白。然后在體外通過等量滴定熱微量?jī)x(ITC)研究化合物E與TPP是否具有結(jié)合作用;通過酶學(xué)實(shí)驗(yàn)測(cè)定化合物E是否能有效抑制TPP的酶活性;構(gòu)建過表達(dá)和低表達(dá)TPP蛋白的H37Ra菌株，觀察與野生型H37R