成年大鼠全腦嚴重缺血誘導的神經(jīng)元死亡機制及3-甲基腺嘌呤的作用研究.pdf

1、目前，心腦血管病位居我國死亡原因的第一位。腦組織對缺血缺氧的敏感性高、耐受性低，損傷往往最為嚴重，且決定著患者的預后。有研究發(fā)現(xiàn)自噬參與腦缺血缺氧損傷，迄今，成年動物全腦缺血復灌損傷中3-MA是否同樣具有腦保護作用尚不明確。
　　 研究目的：
　　 本研究旨在探討成年大鼠20 min全腦嚴重缺血誘導的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元死亡方式及其死亡機制，在此基礎上進一步探索3-MA對全腦缺血后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元死亡的作用，并闡明其作用

2、機制。
　　 研究方法：
　　 1.全腦缺血模型制作：采用四血管法制作成年大鼠全腦缺血模型，缺血20 min后恢復腦血流灌注。
　　 2.實驗分組：①模型組（control）：全腦缺血20 min;②假手術(shù)組（sham）：除不夾閉雙側(cè)頸總動脈外其他同模型組；③R60組：復灌后60min側(cè)腦室注射600nmol3-MA;④I30組：缺血前30 min側(cè)腦室注射600 nmol3-MA;⑤I60組：缺血前60min側(cè)

3、腦室注射600 nmol3-MA。
　　 3.HE染色：經(jīng)左心室灌注固定、取腦石蠟包埋、制作海馬冠狀切片、常規(guī)HE染色，光鏡下計數(shù)海馬CA1區(qū)每mm存活神經(jīng)元數(shù)量。
　　 4.免疫組化染色：海馬平面冠狀切片，依次經(jīng)過脫臘、熱修復抗原、H2O2孵育、封閉、cathepsin B或cleaved caspase-3一抗孵育、二抗孵育、3，3’-二氨基聯(lián)苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB）顯色、復染、透明

4、、封片等步驟，光學顯微鏡下觀察。
　　 5.TUNEL染色：海馬切片，依次經(jīng)過脫蠟、水化、Proteinase K處理、TUNEL反應混合液反應、converter-POD反應、DAB顯色、復染、脫水、透明、封片等，最后光學顯微鏡觀察。
　　 6.電鏡：海馬CA1和齒狀回（dentate gyrus，DG）組織依次經(jīng)過戊二醛固定、鋨酸固定、脫水、包埋、固化、超薄切片、3％醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，透射電鏡觀察神經(jīng)元形態(tài)學改

5、變。
　　 7.Western blot:大鼠在缺血20min復灌不同時間點斷頭取腦，快速分離海馬，勻漿并離心后提取蛋白，蛋白定量后進行Western blot檢測。
　　 實驗結(jié)果：
　　 1.HE染色結(jié)果表明20min全腦缺血誘導的神經(jīng)元死亡仍以海馬CA1區(qū)為主，呈現(xiàn)出遲發(fā)性死亡過程，復灌7天后CA1區(qū)95.2％神經(jīng)元死亡。
　　 2.復灌72小時（hour,h）后絕大部分CA1區(qū)變性神經(jīng)元TUNEL

6、染色陽性，表明DNA有規(guī)律地斷裂，提示海馬CA1區(qū)神經(jīng)元死亡為程序性死亡。
　　 3.電鏡下觀察到細胞器空泡變性、細胞膜、核膜溶解消失、核碎裂、膠質(zhì)細胞增生等形態(tài)學改變，符合壞死的形態(tài)學特征。同時可觀察到自噬小體和自噬溶酶體的形成，但未觀察到凋亡結(jié)構(gòu)，這些形態(tài)學改變符合程序性壞死。
　　 4.Western blot及免疫組化研究結(jié)果均提示全腦缺血20min復灌后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元無caspase-3表達的增加和激活，說

7、明caspase-3依賴的凋亡不參與海馬CA1區(qū)神經(jīng)元程序性壞死。
　　 5.Westem blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺血20min復灌1-48hLC3-Ⅱ表達增加，提示復灌階段自噬激活。
　　 6.海馬組織中cathepsin B主要以活化形式儲存于溶酶體內(nèi)，全腦缺血復灌損傷時cathepsin B的表達和激活均未出現(xiàn)明顯改變。但復灌48 h后可見cathepsin B從溶酶體內(nèi)釋放到細胞質(zhì)和細胞核中，且與神經(jīng)元變性死亡密切相關(guān)

8、，說明cathepsin B的釋放可能是神經(jīng)元死亡的決定性因素。
　　 7.缺血前側(cè)腦室注射600nmol3-MA能顯著抑制神經(jīng)元死亡，且具有時間依賴性，缺血前60 min較缺血前30 min給藥更為有效，而復灌后60 min注射3-MA無保護作用。
　　 8.TUNEL染色表明缺血前側(cè)腦室注射600 nmol3-MA能顯著減少TUNEL陽性神經(jīng)元數(shù)量。
　　 9.缺血前、后側(cè)腦室注射600 nM3-MA對cat

9、hepsin B的表達以及激活均無影響，但缺血前側(cè)腦室注射600 nM3-MA能顯著抑制 cathepsin B的釋放。
　　 結(jié)論：
　　 1.成年大鼠全腦缺血20 min后海馬 CA1區(qū)神經(jīng)元死亡主要是由溶酶體酶cathepsin B釋放所介導的一種程序性壞死。
　　 2.3-MA對缺血誘導的神經(jīng)元程序性壞死具有時間依賴性的保護作用，抑制cathepsin B的釋放可能是其主要的作用機制。
　　 3.