血府逐瘀湯對外傷性視神經(jīng)病變神經(jīng)節(jié)細(xì)胞作用的實驗研究.pdf

1、目的：
　　 建立外傷性視神經(jīng)病變(traumatic optic neuropathies，TON)大鼠模型，從視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells，RGCs)存活狀態(tài)、組織形態(tài)學(xué)、軸突修復(fù)影響因素三個方面觀察血府逐瘀湯及其拆方對TON大鼠RGCs的影響，探討其部分作用機(jī)制，為臨床用藥提供客觀依據(jù)和指導(dǎo)。
　　 方法：
　　 1.以鉗夾傷大鼠視神經(jīng)為TON動物模型，觀察血府逐瘀湯及其拆

2、方對大鼠RGCs存活狀態(tài)的影響，計算存活率，篩選血府逐瘀湯最佳組方。
　　 2.采用組織病理學(xué)技術(shù)觀察血府逐瘀湯最佳組方干預(yù)后3天、1周、2周、4周，鉗夾傷大鼠視網(wǎng)膜厚度和視神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)變化。
　　 3.采用免疫組織化學(xué)方法觀察藥物干預(yù)后3天、1周、2周、4周，生長相關(guān)蛋白GAP—43(growth associated protein43，GAP—43)、Rho激酶(rho—associated coiled—coil

3、forming protein kinase，ROCKⅡ)在鉗夾傷大鼠視網(wǎng)膜、視神經(jīng)組織中的表達(dá)情況。視網(wǎng)膜表達(dá)強(qiáng)度以平均光密度(average optical density，AOD)表示，視神經(jīng)表達(dá)強(qiáng)度以積分光密度(integrated optical density，IOD)表示。
　　 結(jié)果：
　　 1.血府逐瘀湯對TON大鼠RGCs存活率的影響
　　 各組RGCs平均存活率分別為：蒸餾水組62.84±1

4、0.96％；燈盞細(xì)辛組75.76％±/8.87％；血府逐瘀湯全方組89.18％±/10.59％；血府逐瘀湯活血組69.68％±5.26％；血府逐瘀湯理氣組66.95％±/9.12％。血府逐瘀湯全方組RGCs存活率明顯高于其它各組(P<0.01)，血府逐瘀湯全方為最佳方藥。
　　 2.血府逐瘀湯對TON大鼠視網(wǎng)膜視神經(jīng)組織形態(tài)學(xué)的影響
　　 (1)視網(wǎng)膜厚度
　　 ①3天
　　 視網(wǎng)膜內(nèi)層(retinal

5、length，RL)、神經(jīng)纖維層(nerve fiber layer，NFL)、節(jié)細(xì)胞層(ganglion cell layer，GCL)、內(nèi)叢狀層(inner plexiform layer，IPL)和內(nèi)核層(inner nuclearlayer，INL)：各組均增加，組間同層比較沒有顯著性差異(P>0.05)。
　　 ②1周
　　 RL和IPL：各組繼續(xù)增加，組間同層比較沒有顯著性差異(P>0.05)；NFL：各組輕

6、度降低，組間同層比較沒有顯著性差異(P>0.05)；GCL：治療組和陽性對照組降低，模型組增加，治療組明顯低于模型組(P<0.05)； INL：各組輕度增加，治療組明顯低于模型組(P<0.05)。
　　 ③2周
　　 RL、IPL和INL：各組繼續(xù)增加，組間同層比較沒有顯著性差異(P>0.05);NFL：各組均降低，組間沒有顯著性差異(P>0.05)；GCL：各組均增加，陽性對照組低于模型組(P<0.05)，治療組和模型

7、組沒有顯著性差異(P>0.05)。
　　 ④4周
　　 RL、NFL和INL：各組明顯降低，組間同層比較沒有顯著性差異(P>0.05);GCL：各組厚度降低，治療組和陽性對照組均高于模型組(P<0.05)；IPL：各組明顯降低，治療組高于模型組、陽性對照組(P<0.05)。
　　 (2)視神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)
　　 ①3天：模型組、治療組均可見髓鞘板層分離、崩解，軸膜回縮，或外凸卷曲；軸突數(shù)目減少，部分軸突崩解呈

8、空泡狀，或退變形似蜂窩狀；微絲微管數(shù)目明顯減少，線粒體腫脹，嵴間隙增寬，嵴模糊不清，或完全崩解、消失。
　　 ②1周：模型組、治療組均可見髓鞘板層分離范圍進(jìn)一步擴(kuò)大，結(jié)構(gòu)疏松，部分向內(nèi)、外突起，泡狀解離，出現(xiàn)大量崩解產(chǎn)物；部分神經(jīng)纖維塌陷形成“洋蔥樣”小體；微絲微管數(shù)目進(jìn)一步減少，排列紊亂，線粒體腫脹，數(shù)目減少。
　　 ③2周：模型組、治療組上述改變繼續(xù)加重，髓鞘呈薄膜樣結(jié)構(gòu)，泡狀解離，巨噬細(xì)胞內(nèi)見含有大量髓鞘碎片的吞噬

9、泡；部分軸突空虛透明；微絲微管數(shù)目繼續(xù)減少，線粒體溶解消失。膠質(zhì)細(xì)胞增生明顯，核質(zhì)濃縮成塊，胞質(zhì)更為疏松，大部分線粒體溶解消失，存在大量吞噬了髓鞘碎屑的溶酶體。
　　 ④4周：模型組髓鞘板層結(jié)構(gòu)有所修復(fù)，比正常明顯變薄，結(jié)構(gòu)疏松;部分軸突恢復(fù)，少量變性消失；微管、微絲及線粒體數(shù)目有所增多，但較正常減少，線粒體結(jié)構(gòu)模糊。膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，胞核呈不規(guī)則形，染色質(zhì)固縮成塊，胞質(zhì)內(nèi)線粒體增多，可見大量膠質(zhì)纖維。治療組髓鞘板層結(jié)構(gòu)明顯修

10、復(fù)，較模型組增厚、致密；大量軸突逐漸恢復(fù)，電子密度增高;微管、微絲數(shù)目明顯較模型組增多，分布均勻，線粒體結(jié)構(gòu)清晰。膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)基本正常，胞核呈圓形、橢圓形，染色質(zhì)分布較模型組均勻，胞質(zhì)內(nèi)見大量膠質(zhì)纖維。
　　 3.血府逐瘀湯對RGCs修復(fù)環(huán)境的影響
　　 (1)GAP—43在鉗夾傷大鼠視網(wǎng)膜、視神經(jīng)中的表達(dá)
　　 ①正常大鼠：視網(wǎng)膜：表達(dá)微弱，主要集中于GCL。視神經(jīng)：表達(dá)微弱。
　　 ②3天：視網(wǎng)膜：各

11、組表達(dá)均增強(qiáng)，組間沒有顯著性差異(P>0.05)。視神經(jīng)：各組表達(dá)均明顯增強(qiáng)，組間沒有顯著性差異(P>0.05)。
　　 ③1周：視網(wǎng)膜：各組表達(dá)持續(xù)增強(qiáng)，治療組AOD值明顯高于模型組、陽性對照組(P<0.05)。視神經(jīng)：模型組減弱，治療組和陽性對照組增強(qiáng)，二者沒有顯著性差異(P>0.05)，均高于模型組(P<0.05)。
　　 ④2周：視網(wǎng)膜：各組表達(dá)均減弱，治療組AOD值低于陽性對照組(P<0.05)，和模型組沒有顯

12、著性差異(P>0.05)。視神經(jīng)：模型組減弱，治療組和陽性對照組增強(qiáng)，二者沒有顯著性差異(P>0.05)，均高于模型組(P<0.05)。
　　 ⑤4周：視網(wǎng)膜：各組表達(dá)均減弱，治療組高于模型組(P<0.05)，和陽性對照組沒有顯著性差異(P>0.05)。視神經(jīng)：各組表達(dá)均減弱，組間比較沒有顯著性差異(P>0.05)。
　　 (2)ROCKⅡ在鉗夾傷大鼠視網(wǎng)膜、視神經(jīng)中的表達(dá)
　　 ①正常大鼠：視網(wǎng)膜：表達(dá)微弱，主

13、要集中在GCL和IPL。視神經(jīng)：表達(dá)微弱。
　　 ②3天：視網(wǎng)膜：模型組和陽性對照組明顯增強(qiáng)，治療組減弱，AOD值明顯低于模型組(P<0.05)、陽性對照組(P<0.05)。視神經(jīng)：各組表達(dá)明顯增強(qiáng)，治療組IOD值低于模型組(P<0.05)，和陽性對照組沒有顯著性差異(P>0.05)。
　　 ③1周：各組表達(dá)均減弱，組間比較沒有顯著性差異(P>0.05)。視神經(jīng)：各組表達(dá)明顯減弱，治療組IOD值明顯低于模型組(P<0.0

14、5)、陽性對照組(P<0.05)。
　　 ④2周：視網(wǎng)膜：各組表達(dá)較7天時增強(qiáng)，治療組最弱，三組沒有顯著性差異(P>0.05)。視神經(jīng)：模型組、陽性對照組輕度減弱，治療組明顯減弱，IOD值明顯低于模型組(P<0.05)、陽性對照組(P<0.05)。
　　 ⑤4周：視網(wǎng)膜：各組表達(dá)繼續(xù)增強(qiáng)，治療組最弱，AOD值明顯低于模型組(P<0.05)，和陽性對照組沒有顯著性差異(P>0.05)。視神經(jīng)：各組表達(dá)均增強(qiáng)，治療組IOD值

15、明顯低于模型組(P<0.05)、陽性對照組(.P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.血府逐瘀湯全方能夠明顯提高TON大鼠RGCs存活率，優(yōu)于單純的活血藥、理氣藥。
　　 2.血府逐瘀湯能夠在一定時間一定程度上緩解TON大鼠視網(wǎng)膜組織水腫，延緩視網(wǎng)膜萎縮變薄，保護(hù)視神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)，為軸漿運(yùn)輸功能的恢復(fù)提供物質(zhì)基礎(chǔ)和載體。
　　 3.血府逐瘀湯能在一定程度上增強(qiáng)組織中GAP—43的表達(dá)，同時，強(qiáng)烈抑制ROC