非甾體抗炎藥抑制成骨細(xì)胞增生和分化研究.pdf

1、目的：
　　探討非甾體類抗炎藥（non-steroidal anti-inflammatory durgs,NSAIDs）在成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中的作用，并探討經(jīng)典Wnt信號(hào)通路在其中的作用機(jī)制。
　　方法：
　?。?）采用Ficoll密度梯度離心法體外分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)，并進(jìn)行傳代。
　　（2）取傳至3-5代的大鼠骨髓

2、間充質(zhì)干細(xì)胞，加入含地塞米松（10-8 mol/L）、β-甘油磷酸鈉（10-2 mol/L）、維生素C（0.05 g/L）等試劑的L-DMEM條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞，在細(xì)胞增殖和分化的過(guò)程中，分別加入不同濃度的雙氯芬酸鈉或塞來(lái)昔布（每組 n=5）。
　　（3）采用CCK-8試劑盒測(cè)定雙氯芬酸鈉或塞來(lái)昔布對(duì)BMSCs增殖活性的影響。
　　（4）堿性磷酸酶（alkalinephosphatase,ALP）染色分析雙氯芬酸鈉

3、對(duì)BMSCs向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中ALP表達(dá)的影響，鈣鹽染色分析塞來(lái)昔布對(duì)BMSCs向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中鈣鹽沉積的影響，使用ImagePro Plus6.0軟件分析，計(jì)算IOD sum/Area sum值。
　?。?）通過(guò)RT-PCR檢測(cè)塞來(lái)昔布對(duì)成骨細(xì)胞關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子RUNX2 mRNA以及經(jīng)典Wnt信號(hào)通路中β-catenin mRNA表達(dá)的影響，使用Image J軟件分析RUNX2灰度值/GAPDH灰度值、β-caten

4、in灰度值/GAPDH灰度值。
　　結(jié)果：
　?。?）倒置相差顯微鏡下觀察BMSCs形態(tài)多樣，呈體積較大的圓形的單個(gè)核細(xì)胞，培養(yǎng)24小時(shí)后有細(xì)胞開(kāi)始貼壁，貼壁的細(xì)胞有橢圓狀、淚滴狀、梭形及纖維狀等，分布不均勻。5天后首次換液，10天后所見(jiàn)細(xì)胞基本呈梭形或纖維狀，胞體大，胞核大，呈圓形或橢圓形，胞漿富含顆粒。當(dāng)細(xì)胞融合至80％-90%時(shí)，可進(jìn)行傳代。
　?。?）CCK-8試劑盒測(cè)定結(jié)果顯示，1.25 umol/L、2.5

5、 umol/L、5.0 umol/L、10.0 umol/L雙氯芬酸鈉對(duì)BMSCs增殖的抑制率分別為7.08%、12.42%、16.28%、21.10%（不同劑量組兩兩比較，P<0.001），1.25 umol/L、2.5 umol/L、5.0 umol/L、10.0 umol/L塞來(lái)昔布的抑制率分別為7.27%、11.87%、12.78%、14.71%（不同劑量組兩兩比較，P<0.001），表明雙氯芬酸鈉或塞來(lái)昔布對(duì) BMSCs增殖均

6、呈現(xiàn)抑制作用，抑制作用呈劑量依賴。1.25 umol/L組雙氯芬酸鈉與塞來(lái)昔布對(duì)BMSCs增殖抑制率別為7.08%、7.27%，2.5 umol/L組雙氯芬酸鈉與塞來(lái)昔布對(duì)BMSCs增殖抑制率別為12.42%、11.87%（同一濃度組之間比較，P>0.05），表明雙氯芬酸鈉組與塞來(lái)昔布對(duì)BMSCs增殖的抑制差別不大。
　　（3）在條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)7天后進(jìn)行ALP染色，10 umol/L雙氯芬酸鈉組ALP的表達(dá)明顯低于對(duì)照組，IOD

7、sum/Area sum值分別為0.270±0.256和0.412±0.113（P<0.05）；在誘導(dǎo)14天后，茜素紅S染色結(jié)果顯示，10 umol/L塞來(lái)昔布組鈣鹽沉積量明顯少于對(duì)照組，IOD sum/Area sum值分別為0.319±0.018和0.412±0.113（P<0.05），表明雙氯芬酸鈉抑制了分化過(guò)程中的堿性磷酸酶，塞來(lái)昔布抑制了分化過(guò)程中的鈣鹽沉積。
　?。?）RT-PCR結(jié)果顯示，0 umol/L、1.25

8、umol/L、2.5 umol/L、5.0 umol/L、10.0 umol/L塞來(lái)昔布組的RUNX2灰度值/GAPDH灰度值分別為0.7985±0.0356、0.6131±0.0244、0.3926±0.0189、0.2553±0.0294、0.1348±0.0071（不同濃度兩兩比較，P<0.001），β-catenin灰度值/GAPDH灰度值分別為0.7959±0.03136、0.4002±0.0177、0.3388±0.0336