黑色素瘤相關(guān)抗原Restin和轉(zhuǎn)錄因子ATF3相互作用效應(yīng)的研究.pdf

1、Restin是1999年本校生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室在研究全反式維甲酸誘導(dǎo)細(xì)胞分化時克隆得到的一個未知功能的人類新基因，2001年，Chomez等通過同源序列篩選Genebank數(shù)據(jù)庫，也發(fā)現(xiàn)了該基因，并命名為MAGE-H1，該基因主要表達(dá)于終末分化細(xì)胞。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染該基因的細(xì)胞出現(xiàn)G1期阻滯，抑制細(xì)胞的增殖，提示Restin與細(xì)胞周期的調(diào)控有關(guān)。但有關(guān)該基因的具體生物學(xué)功能研究還未見報道。 實(shí)驗(yàn)前期研究利用細(xì)胞雙雜交技術(shù)，對Re

2、stin在細(xì)胞周期中可能的作用的轉(zhuǎn)錄因子(ATF3、ATF4、E2F6、C-JUN、C-FOS、p53)進(jìn)行了雙雜交篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ATF3與Restin表現(xiàn)出很強(qiáng)的相互作用。為了進(jìn)一步驗(yàn)證ATF3與Restin的相互作用，對ATF3進(jìn)行截短并構(gòu)建了一系列ATF3的截短片段的雙雜交質(zhì)粒，再次運(yùn)用細(xì)胞雙雜交進(jìn)行相互作用的探索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Restin與ATF3的確存在相互作用，并作用于ATF3的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(ATF3bindingdomai

3、n,ATF3/BD)，不完整的ATF3/BD降低了Restin與ATF3相互作用能力，進(jìn)一步證實(shí)了Restin與ATF3相互作用。 激活轉(zhuǎn)錄因子—3(ActivatingTranscriptionFactor3，ATF3)是一種具有堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)(basicleucinezipper，bZIP)的cAMP應(yīng)答元件結(jié)合的蛋白質(zhì)(cAMP-responsiveelementbindingprotein，CREB)家族中的轉(zhuǎn)錄因子

4、，具有廣泛的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。ATF3通過和具有特異性結(jié)合位點(diǎn)ATF/CRE(TGACGTCA)或者AP-1的因子結(jié)合而發(fā)揮其功能。ATF3是細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中最早表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子之一，ATF3在正常的條件下以及靜息狀態(tài)表達(dá)很低，但是多種細(xì)胞外刺激信號可以誘導(dǎo)其表達(dá)，細(xì)胞的mRNA水平在暴露于壓力信號時會增高很多。目前發(fā)現(xiàn)在動物模型，ATF3表達(dá)增高見于心肌缺血及缺血-再灌注損傷、肝臟缺血及酒精或四氯化碳等化學(xué)藥物中毒、癲癇發(fā)作、腎臟的缺血-再灌

5、注損傷、皮膚外傷及外周神經(jīng)離斷；在培養(yǎng)的細(xì)胞ATF3可以被大量的信號誘導(dǎo)，包括：細(xì)胞因子、具有遺傳毒性的因素如紫外線及電離輻射、已知的能引起細(xì)胞死亡或激活JNK/SAPK途徑的因子如茴香毒素(抗滴蟲藥)和阿霉素等。近來又有很多研究發(fā)現(xiàn)了更多新的可以誘導(dǎo)ATF3表達(dá)的壓力性因素。盡管這些證據(jù)無疑可以證明ATF3是一個壓力誘導(dǎo)基因，但是關(guān)于對ATF3的調(diào)控及其生理功能目前研究甚少。 ATF3作為組織或細(xì)胞生理壓力性誘導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)中最早

6、表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子之一，一方面，ATF3可以誘導(dǎo)細(xì)胞從靜止期進(jìn)入細(xì)胞周期；另一方面它又可阻止毒性物質(zhì)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。激活的ATF3可以通過JNK/SAPK信號傳遞途徑抑制細(xì)胞內(nèi)部分基因的轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞的增殖。因此我們推測Restin對細(xì)胞增殖的調(diào)控作用可能與對ATF3活性的調(diào)控有關(guān)。 為了證實(shí)這一想法，進(jìn)一步研究Restin和ATF3相互作用的效應(yīng)，我們必須建立一個可以進(jìn)行活體檢測ATF3轉(zhuǎn)錄活性的報告系統(tǒng)，當(dāng)然要求這個報告系統(tǒng)可以在細(xì)

7、胞內(nèi)有效地檢測ATF3的活性。為了構(gòu)建這個報告系統(tǒng)，利用了Promega公司的載體質(zhì)粒pG5luc，它帶有螢火蟲熒光素酶基因，在其上游依次為腺病毒啟動子，5個GAL-4結(jié)合位點(diǎn)，通過酶切連接用ATF3的特異性結(jié)合位點(diǎn)ATF/CRE序列完全取代GAL4結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建完成ATF3報告質(zhì)粒pATF/CRE-luc。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在Hela和NIH3T3細(xì)胞內(nèi)，熒光素酶的表達(dá)量在共轉(zhuǎn)染ATF3和ATF/CRE實(shí)驗(yàn)組較之單獨(dú)轉(zhuǎn)染ATF/CRE組要高

8、得多，且螢火蟲熒光素酶的表達(dá)量和轉(zhuǎn)染的ATF3劑量呈正相關(guān)，這說明我們成功構(gòu)建了在細(xì)胞內(nèi)具有轉(zhuǎn)錄活性的ATF3活性報告系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明在Hela和NIH3T3細(xì)胞內(nèi)ATF3的基礎(chǔ)活性很低，能夠更準(zhǔn)確地反應(yīng)各種刺激因素對其的調(diào)控影響。無疑，這個報告系統(tǒng)有助于我們進(jìn)一步研究Restin和ATF3的相互作用，當(dāng)然也可以為我們進(jìn)一步研究在不同細(xì)胞和不同壓力狀態(tài)下ATF3的表達(dá)調(diào)控提供一個有力的工具。 利用構(gòu)建的ATF3的報告系統(tǒng)pA

9、TF/CRE-luc，對Restin與ATF3相互作用效應(yīng)進(jìn)行了一系列的分析。為檢測Restin對ATF3轉(zhuǎn)錄激活的影響，我們將ATF3和Restin基因的表達(dá)質(zhì)粒pACT/ATF3和pACT/Restin及報告基因pATF/CRE-luc質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞，結(jié)果顯示：在表達(dá)ATF3的情況下，共轉(zhuǎn)染Restin可以增強(qiáng)ATF3的轉(zhuǎn)錄激活，將ATF3-BD和Restin的表達(dá)質(zhì)粒及報告基因pATF/CRE-luc質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染NIH3

10、T3細(xì)胞，結(jié)果顯示ATF3-BD可以部分阻抑Restin與ATF3相互作用效應(yīng)，進(jìn)一步證實(shí)了Restin對報告系統(tǒng)熒光素酶表達(dá)的增強(qiáng)效應(yīng)是通過Restin與ATF3的相互作用實(shí)現(xiàn)的。在Hela和A549細(xì)胞重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)得到一致的結(jié)果。 為了進(jìn)一步證實(shí)在細(xì)胞中Restin和ATF3相互作用的效應(yīng)，對ATF3調(diào)控的下游靶基因CyclinD1的表達(dá)進(jìn)行了觀察。CyclinD1具有延遲早期表達(dá)的動力學(xué)特性，在G1時相的中晚期達(dá)到峰值，C

11、yclinD1的這種表達(dá)特性符合作為ATF3目的基因的條件；更重要的是，CyclinD1的啟動子區(qū)包含ATF3的兩個DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，在2953位點(diǎn)的一個AP-1(TGAGTCAG)序列及254位點(diǎn)的一個ATF/CRE(TAACGTCA)序列；最后CyclinD1的啟動子已經(jīng)被證實(shí)與bZIP家族的轉(zhuǎn)錄因子激活，包括c-Jun,c-Fos，F(xiàn)osB和ATF2。并且，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)ATF3在肝細(xì)胞的過度表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)源性CyclinD1mR

12、NA表達(dá)增高，并且ATF3的這種效應(yīng)是通過結(jié)合到AP-1位點(diǎn)介導(dǎo)的。 CyclinD1是細(xì)胞周期調(diào)控中的一個非常重要的因子。真核細(xì)胞的增殖調(diào)控發(fā)生在細(xì)胞周期的特異性時相。大量的研究證實(shí)了CyclinD1是作用于G1期的重要細(xì)胞周期蛋白，可以促進(jìn)G1～S期轉(zhuǎn)換。CyclinD1發(fā)揮功能是通過在細(xì)胞周期G1期激活CDK4/6，接著催化了抑癌蛋白pRb的磷酸化失活，從而導(dǎo)致抑制與細(xì)胞增殖相關(guān)的E2F等目的基因。這些結(jié)果提示Cyclin

13、D1的過表達(dá)和人類腫瘤的發(fā)展有密切關(guān)系。CyclinD1在沒有CDK的參與時還會影響不同的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的活性(例如雌激素和雄激素的受體)。目前為止，這種特性僅在轉(zhuǎn)染構(gòu)建的報告系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)中見到，所以這種所謂的CyclinD1的對內(nèi)源性基因的轉(zhuǎn)錄活性的提法目前還存有爭議。然而，這些觀察結(jié)果確實(shí)暗示著CyclinD1存在另一個非CDK依賴性的生物學(xué)活性。 因此在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，我們觀察了Restin和ATF3的相互作用對CyclinD

14、1的表達(dá)的影響。通過打點(diǎn)雜交的技術(shù)和α-32P標(biāo)記的同位素CyclinD1cDNA探針雜交實(shí)驗(yàn)及放射自顯影技術(shù)，觀察了在NIH3T3細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染ATF3和Restin基因后CyclinD1的mRNA表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)單獨(dú)轉(zhuǎn)染Restin或ATF3表達(dá)質(zhì)粒具有輕微的增強(qiáng)CyclinD1mRNA表達(dá)的效應(yīng)，而在共轉(zhuǎn)染Restin和ATF3表達(dá)質(zhì)粒后，CyclinD1mRNA的表達(dá)發(fā)生了顯著的增強(qiáng)，因此我們推測：Restin在細(xì)胞處于壓力情形下