樹突細胞與細胞因子誘導的殺傷細胞共培養(yǎng)對多藥耐藥腫瘤細胞系的殺傷活性研究.pdf

1、目的；樹突狀細胞(Dendriticcell，DC)是已知體內(nèi)功能最強的抗原提呈細胞(antigenpresentingcells，APCs)，不僅可以激發(fā)特異性免疫應答，引起相應的特異性殺傷效應，而且，還可以促進非特異性的細胞毒殺傷。細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine-inducedkillercells，CIKs)是在多種細胞因子(IL-2、IL-1、IFN-γ、抗CD3單克隆抗體等)作用下，由外周血、骨髓或臍血中分離出的單個

2、核細胞，培養(yǎng)而獲得的一種具有細胞毒作用的免疫活性細胞，其抗腫瘤細胞的主要機制是非MHC(主要組織相容性復合體)限制性殺傷。有資料表明DC和CIK細胞共培養(yǎng)之后，可以促進DC的成熟，分泌大量IL-12，同時CIK細胞也可以獲得大量增殖、分泌大量IFN-γ、明顯增強對靶細胞的殺傷效應。有趣的是，DC對T細胞刺激時，也可以分泌大量IL-12，激活的T細胞也會分泌大量的IFN-γ；在CIK細胞中，CD3+CD56+細胞作為發(fā)揮非特異殺傷的主要細

3、胞，僅占CIK細胞總數(shù)的35.5％，而CD3+CD56細胞占總數(shù)的58％，其中大部分被證明是CD8+細胞；同時在CIK細胞培養(yǎng)初期，可以檢測到CD45RA表型，該表型是幼稚T細胞(naiveTcell)表面標志，隨著CIK細胞成熟，該表型明顯下降。上述資料均表明，在CIK細胞中有可能存在一定數(shù)量的T細胞，那么這部分T細胞能否對表達特異性抗原的腫瘤細胞產(chǎn)生特異性殺傷呢?為進一步驗證上述想法，本實驗特采用表達P-gp特異性抗原的乳腺癌細胞M

4、CF-7/ADR進行凍融抗原，進而沖擊DC，然后與CIK細胞共培養(yǎng)，觀察其針對表達P-gp抗原的MCF-7/ADR細胞的特異性殺傷。 方法；采集健康人骨髓分離獲得單個核細胞(BMMNC)，分別培養(yǎng)得到DC和CIK。部分DC接受人類乳腺癌耐藥細胞株MCF-7/ADR細胞的凍融物抗原沖擊。實驗分組為：1)實驗組：抗原沖擊DC與CIK共育；2)DC對照組：DC和CIK細胞共育；3)空白對照組：CIK細胞單獨培養(yǎng)15天。應用流式細胞儀對

5、各組細胞進行DC表型、CIK表型測定，應用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定DC、CIK分泌IL-12、IFN-γ水平，MTT法測定三組細胞對表達P-gp抗原的MCF-7/ADR耐藥株和敏感株細胞MCF-7的殺傷效應。 結(jié)果；試驗組、DC對照組分別與它們各自共培養(yǎng)前比較，其成熟表型均明顯高于培養(yǎng)前，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.003、P=0.001)。CIK細胞表型(CD3、CD8、CD56)檢測：三組間均具有表型差異(分別為實驗組

6、：DC對照組P=0.003，實驗組：空白對照組P=0.011，DC對照組：空白對照組P=0.039)；空白對照組與CIK單獨培養(yǎng)第7天的表型比較也有顯著性差異(P=0.014)。此外，在所測CIK表型中，CD3+CD56+細胞表型實驗組明顯高于兩對照組(實驗組：DC對照組P=0.001，實驗組：空白對照組P＜0.001)；CD3+CD8+細胞表型實驗組也高于DC對照組和空白對照組(P=0.002，P=0.002)；CD45RA同樣在實驗

7、組與兩對照組(DC對照組、空白對照組)有顯著性差異，但其在實驗組中是表達最低的(實驗組：DC對照組P＜0.001，實驗組：空白對照組P=0.004)。ELISA檢測結(jié)果表明：IL-12、IFN-γ水平在實驗組表達最高，分別為254±14.5pg/ml、3100±286pg/ml。針對有耐藥抗原表達的MCF-7/ADR細胞，實驗組殺傷效應最強，其次為DC對照組，空白對照組最弱，三組間均具有顯著性差異(實驗組：DC對照組P=0.039，實驗

8、組：空白對照組P=0.002，DC對照組：空白對照組P=0.049)；而對于無P-gp抗原表達的MCF-7細胞的殺傷效應，實驗組和DC對照組之間無明顯差異，但均高于空白對照組，差異有顯著性(實驗組：空白對照組P=0.007，DC對照組：空白對照組P=0.048)。 結(jié)論；我們成功地從人骨髓培養(yǎng)得到DC和CIK細胞，二者共培養(yǎng)后，能促進各自特征性表面標志表達上調(diào)，并分泌大量相關(guān)細胞因子，觀察到了細胞殺傷效應的明顯提高及可能的特異性