射頻消融與細胞因子誘導的殺傷細胞協(xié)同抗腫瘤效應的研究.pdf

1、射頻消融(Radiofrequency ablation，RFA)是目前廣泛應用于臨床的微創(chuàng)治療手段。其不僅通過物理熱效應直接損毀腫瘤，而且消融使腫瘤抗原暴露，刺激機體產(chǎn)生免疫反應。然而，射頻消融引起的抗腫瘤免疫反應并不足以阻止腫瘤的復發(fā)及轉移。
　　細胞因子誘導的殺傷(Cytokine-induced killer，CIK)細胞是外周血單個核細胞在體外經(jīng)有序添加多種細胞因子(IL-2、抗CD3單克隆抗體、IFN-γ等)培養(yǎng)后獲得

2、的一組異質性細胞群。其兼有T淋巴細胞的殺瘤活性和自然殺傷細胞樣非組織相容性復合物(MHC)限制性的抗瘤特點。然而，在實體瘤治療方面，CIK細胞治療仍然處于輔助地位，單獨應用往往療效不佳。影響CIK細胞在體內發(fā)揮作用的一個重要因素是:效應性免疫細胞能否到達靶器官，實現(xiàn)與腫瘤細胞的直接接觸，從而有效殺傷腫瘤細胞。
　　據(jù)此，理論上，在消融治療后的恰當時間內輸注CIK細胞，消融產(chǎn)生的免疫刺激可能促進CIK細胞向腫瘤部位遷移、定植，增強C

3、IK細胞的體內抗腫瘤效應。同時，CIK細胞在腫瘤部位聚集又可放大消融誘發(fā)的抗腫瘤免疫反應，兩者相互增效產(chǎn)生最大的協(xié)同治療效能。
　　本課題從動物實驗到臨床試驗兩部分探討射頻消融聯(lián)合CIK細胞的協(xié)同抗腫瘤效應。
　　第一部分 射頻消融與CIK細胞協(xié)同抗腫瘤效應的動物實驗研究
　　目的:觀察RFA聯(lián)合CIK細胞的協(xié)同抗腫瘤作用，探討RFA對CIK細胞體內遷移及殺瘤活性的影響及可能作用機制。
　　方法:1、建立小鼠雙側

4、背部B16黑色素瘤與CT26結腸癌皮下移植瘤模型，利用荷瘤鼠脾臟細胞培養(yǎng)CIK細胞，檢測CIK細胞表面趨化因子受體的表達。2、成瘤小鼠分四組:單獨右側腫瘤RFA治療組、單獨CIK治療組、兩者聯(lián)合治療組及未治療對照組，記錄未消融側腫瘤大小與小鼠生存時間，繪制生存曲線。3、采用流式細胞術分析各治療組未消融側腫瘤內淋巴細胞亞群比例與數(shù)量、免疫抑制性細胞群:調節(jié)性T細胞(T regulatory cell，Treg)，髓源性抑制細胞(Myelo

5、id-derived suppressor cells,MDSC)的比例。4、利用不同免疫表型小鼠檢測消融后浸潤至未消融側腫瘤內外源性CIK細胞的數(shù)量與活性。5、采用ELISA法及RealTime-PCR技術檢測單純消融后1、3、6、9、12天未消融側腫瘤內趨化因子CXCL10的表達，利用Cxcl10Ko小鼠檢測CXCL10在RFA激發(fā)抗腫瘤免疫反應，促進CIK細胞遷移中的作用。6、評估RFA與CIK細胞輸注時間間隔對治療效果的影響。<

6、br>　　結果:1、成功培養(yǎng)CIK細胞，高表達趨化因子受體CXCR3、CXCR4、CCR5。2、RFA與CIK單獨治療均可產(chǎn)生短暫的抑制腫瘤生長作用，而聯(lián)合治療能顯著抑制未消融側腫瘤生長;聯(lián)合治療組生存期為42±3.3d，顯著長于未治療對照組(20.5±2.2d)、單獨右側腫瘤RFA治療組(26±2.2d)及單獨CIK治療組(31.5±2.2d)(P＜0.001)。3、聯(lián)合治療組小鼠未消融側腫瘤內淋巴細胞浸潤增加，其中CD8+、CD4+

7、T、NK(CD3-NK1.1+)和NKT(CD3+NK1.1+)細胞數(shù)量均顯著增加;CD8+/Treg(CD4+FoxP3+)比值增大;MDSC比例降低。4、RFA聯(lián)合CIK組較單獨CIK組小鼠未消融側腫瘤內外源性CIK細胞聚集增加，并且外源性CIK細胞Ki-67、可誘導共刺激分子(Inducible costimulator，ICOS)與顆粒酶B(Granzyme B)的表達水平較未RFA組明顯上調。5、RFA動態(tài)上調遠處腫瘤組織CX

8、CL10，CXCL10基因敲除減弱RFA激發(fā)的抗腫瘤免疫應答，影響CIK細胞的遷移。6、RFA后3天輸注CIK細胞能產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤效應，12天后則無明顯協(xié)同效應。
　　結論:1、RFA聯(lián)合CIK細胞治療可增強消融區(qū)外腫瘤微環(huán)境中抗腫瘤免疫反應。2、RFA治療可促進外源性CIK細胞向消融區(qū)外腫瘤內遷移，提高CIK細胞在腫瘤內的增殖能力與殺瘤活性，二者聯(lián)用具有協(xié)同抗腫瘤作用。3、RFA激發(fā)的抗腫瘤免疫反應和CIK細胞的遷移依賴于趨化因

9、子CXCL10。4、RFA與CIK細胞的輸注時間間隔影響療效，應盡早輸注，這對指導兩者聯(lián)合的臨床應用具有重要意義。
　　第二部分 射頻消融聯(lián)合CIK細胞治療結直腸癌肝轉移瘤的臨床研究
　　目的:觀察RFA聯(lián)合靜脈輸注CIK細胞治療結直腸癌術后單純肝轉移患者的有效性和安全性，評估二者聯(lián)合應用對機體腫瘤抗原特異性免疫能力的影響。
　　方法:入組結直腸癌術后單純肝轉移患者60例，經(jīng)多學科團隊討論，簽署知情同意書后分為單純消融

10、組（RFA）:對肝臟轉移瘤消融，不行CIK細胞治療。消融聯(lián)合CIK細胞治療組(RFA+CIK):消融前7天，分離患者外周血單個核細胞(PBMC)，體外培養(yǎng)CIK細胞，肝轉移瘤消融后7天輸注體外培養(yǎng)好的CIK細胞。比較兩組患者的無疾病進展時間(PFS)、總生存時間(OS)、不良反應。ELISPOT法檢測RFA+CIK組中外周血CEA＞50ng/ml的患者消融前、消融后7天(CIK細胞治療前)、消融后14天(CIK細胞治療后)三個時間點，P

11、BMC在CEA抗原肽刺激下分泌IFN-γ的能力。
　　結果:RFA+CIK組和RFA組中位PFS分別是23個月、18個月，2年PFS率分別為41.9％和26.7％，3年PFS率分別為20.3％和13.3％，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.0336)。RFA組的中位OS為43個月，RFA+CIK組目前還在隨訪中。RFA組3年OS率為64.6％，而RFA+CIK組3年OS率為81％，但差異無統(tǒng)計學意義(P=0.1187)。ELISPOT試

12、驗發(fā)現(xiàn)RFA+CIK組，8名外周血CEA＞50ng/ml的患者中，消融后7天(CIK細胞治療前)有6名患者PBMC中具有分泌IFN-γ能力的細胞數(shù)量較消融前增加(P=0.010);而在消融后14天（CIK細胞治療后），有7名患者PBMC中具有分泌IFN-γ能力的細胞數(shù)量較消融后7天(CIK細胞治療前)增加(P=0.028)。這8名患者在消融聯(lián)合CIK細胞治療后PBMC中具有分泌IFN-γ能力的細胞數(shù)量均較治療前增加(P=0.001)，差

13、異有統(tǒng)計學意義。
　　結論:RFA聯(lián)合CIK細胞治療可增強結直腸癌肝轉移患者腫瘤抗原特異性免疫應答，延長疾病進展時間(PFS)，具有協(xié)同抗腫瘤效應。
　　綜上所述，本研究通過動物實驗和臨床試驗兩部分探討RFA聯(lián)合CIK細胞的協(xié)同抗腫瘤效應。動物實驗建立雙側背部荷瘤小鼠模型，利用荷瘤鼠脾臟細胞制備CIK細胞，臨床研究入組結直腸癌術后單純肝轉移患者。本研究明確了:1）RFA聯(lián)合CIK細胞治療可增強消融區(qū)外腫瘤微環(huán)境中抗腫瘤免疫反