射頻消融與細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)的研究.pdf

1、射頻消融(Radiofrequency ablation，RFA)是目前廣泛應(yīng)用于臨床的微創(chuàng)治療手段。其不僅通過(guò)物理熱效應(yīng)直接損毀腫瘤，而且消融使腫瘤抗原暴露，刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。然而，射頻消融引起的抗腫瘤免疫反應(yīng)并不足以阻止腫瘤的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移。
　　細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷(Cytokine-induced killer，CIK)細(xì)胞是外周血單個(gè)核細(xì)胞在體外經(jīng)有序添加多種細(xì)胞因子(IL-2、抗CD3單克隆抗體、IFN-γ等)培養(yǎng)后獲得

2、的一組異質(zhì)性細(xì)胞群。其兼有T淋巴細(xì)胞的殺瘤活性和自然殺傷細(xì)胞樣非組織相容性復(fù)合物(MHC)限制性的抗瘤特點(diǎn)。然而，在實(shí)體瘤治療方面，CIK細(xì)胞治療仍然處于輔助地位，單獨(dú)應(yīng)用往往療效不佳。影響CIK細(xì)胞在體內(nèi)發(fā)揮作用的一個(gè)重要因素是:效應(yīng)性免疫細(xì)胞能否到達(dá)靶器官，實(shí)現(xiàn)與腫瘤細(xì)胞的直接接觸，從而有效殺傷腫瘤細(xì)胞。
　　據(jù)此，理論上，在消融治療后的恰當(dāng)時(shí)間內(nèi)輸注CIK細(xì)胞，消融產(chǎn)生的免疫刺激可能促進(jìn)CIK細(xì)胞向腫瘤部位遷移、定植，增強(qiáng)C

3、IK細(xì)胞的體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)。同時(shí)，CIK細(xì)胞在腫瘤部位聚集又可放大消融誘發(fā)的抗腫瘤免疫反應(yīng)，兩者相互增效產(chǎn)生最大的協(xié)同治療效能。
　　本課題從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)到臨床試驗(yàn)兩部分探討射頻消融聯(lián)合CIK細(xì)胞的協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)。
　　第一部分 射頻消融與CIK細(xì)胞協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:觀(guān)察RFA聯(lián)合CIK細(xì)胞的協(xié)同抗腫瘤作用，探討RFA對(duì)CIK細(xì)胞體內(nèi)遷移及殺瘤活性的影響及可能作用機(jī)制。
　　方法:1、建立小鼠雙側(cè)

4、背部B16黑色素瘤與CT26結(jié)腸癌皮下移植瘤模型，利用荷瘤鼠脾臟細(xì)胞培養(yǎng)CIK細(xì)胞，檢測(cè)CIK細(xì)胞表面趨化因子受體的表達(dá)。2、成瘤小鼠分四組:單獨(dú)右側(cè)腫瘤RFA治療組、單獨(dú)CIK治療組、兩者聯(lián)合治療組及未治療對(duì)照組，記錄未消融側(cè)腫瘤大小與小鼠生存時(shí)間，繪制生存曲線(xiàn)。3、采用流式細(xì)胞術(shù)分析各治療組未消融側(cè)腫瘤內(nèi)淋巴細(xì)胞亞群比例與數(shù)量、免疫抑制性細(xì)胞群:調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(T regulatory cell，Treg)，髓源性抑制細(xì)胞(Myelo

5、id-derived suppressor cells,MDSC)的比例。4、利用不同免疫表型小鼠檢測(cè)消融后浸潤(rùn)至未消融側(cè)腫瘤內(nèi)外源性CIK細(xì)胞的數(shù)量與活性。5、采用ELISA法及RealTime-PCR技術(shù)檢測(cè)單純消融后1、3、6、9、12天未消融側(cè)腫瘤內(nèi)趨化因子CXCL10的表達(dá)，利用Cxcl10Ko小鼠檢測(cè)CXCL10在RFA激發(fā)抗腫瘤免疫反應(yīng)，促進(jìn)CIK細(xì)胞遷移中的作用。6、評(píng)估RFA與CIK細(xì)胞輸注時(shí)間間隔對(duì)治療效果的影響。<

6、br>　　結(jié)果:1、成功培養(yǎng)CIK細(xì)胞，高表達(dá)趨化因子受體CXCR3、CXCR4、CCR5。2、RFA與CIK單獨(dú)治療均可產(chǎn)生短暫的抑制腫瘤生長(zhǎng)作用，而聯(lián)合治療能顯著抑制未消融側(cè)腫瘤生長(zhǎng);聯(lián)合治療組生存期為42±3.3d，顯著長(zhǎng)于未治療對(duì)照組(20.5±2.2d)、單獨(dú)右側(cè)腫瘤RFA治療組(26±2.2d)及單獨(dú)CIK治療組(31.5±2.2d)(P＜0.001)。3、聯(lián)合治療組小鼠未消融側(cè)腫瘤內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)增加，其中CD8+、CD4+

7、T、NK(CD3-NK1.1+)和NKT(CD3+NK1.1+)細(xì)胞數(shù)量均顯著增加;CD8+/Treg(CD4+FoxP3+)比值增大;MDSC比例降低。4、RFA聯(lián)合CIK組較單獨(dú)CIK組小鼠未消融側(cè)腫瘤內(nèi)外源性CIK細(xì)胞聚集增加，并且外源性CIK細(xì)胞Ki-67、可誘導(dǎo)共刺激分子(Inducible costimulator，ICOS)與顆粒酶B(Granzyme B)的表達(dá)水平較未RFA組明顯上調(diào)。5、RFA動(dòng)態(tài)上調(diào)遠(yuǎn)處腫瘤組織CX

8、CL10，CXCL10基因敲除減弱RFA激發(fā)的抗腫瘤免疫應(yīng)答，影響CIK細(xì)胞的遷移。6、RFA后3天輸注CIK細(xì)胞能產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)，12天后則無(wú)明顯協(xié)同效應(yīng)。
　　結(jié)論:1、RFA聯(lián)合CIK細(xì)胞治療可增強(qiáng)消融區(qū)外腫瘤微環(huán)境中抗腫瘤免疫反應(yīng)。2、RFA治療可促進(jìn)外源性CIK細(xì)胞向消融區(qū)外腫瘤內(nèi)遷移，提高CIK細(xì)胞在腫瘤內(nèi)的增殖能力與殺瘤活性，二者聯(lián)用具有協(xié)同抗腫瘤作用。3、RFA激發(fā)的抗腫瘤免疫反應(yīng)和CIK細(xì)胞的遷移依賴(lài)于趨化因

9、子CXCL10。4、RFA與CIK細(xì)胞的輸注時(shí)間間隔影響療效，應(yīng)盡早輸注，這對(duì)指導(dǎo)兩者聯(lián)合的臨床應(yīng)用具有重要意義。
　　第二部分 射頻消融聯(lián)合CIK細(xì)胞治療結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移瘤的臨床研究
　　目的:觀(guān)察RFA聯(lián)合靜脈輸注CIK細(xì)胞治療結(jié)直腸癌術(shù)后單純肝轉(zhuǎn)移患者的有效性和安全性，評(píng)估二者聯(lián)合應(yīng)用對(duì)機(jī)體腫瘤抗原特異性免疫能力的影響。
　　方法:入組結(jié)直腸癌術(shù)后單純肝轉(zhuǎn)移患者60例，經(jīng)多學(xué)科團(tuán)隊(duì)討論，簽署知情同意書(shū)后分為單純消融

10、組（RFA）:對(duì)肝臟轉(zhuǎn)移瘤消融，不行CIK細(xì)胞治療。消融聯(lián)合CIK細(xì)胞治療組(RFA+CIK):消融前7天，分離患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，體外培養(yǎng)CIK細(xì)胞，肝轉(zhuǎn)移瘤消融后7天輸注體外培養(yǎng)好的CIK細(xì)胞。比較兩組患者的無(wú)疾病進(jìn)展時(shí)間(PFS)、總生存時(shí)間(OS)、不良反應(yīng)。ELISPOT法檢測(cè)RFA+CIK組中外周血CEA＞50ng/ml的患者消融前、消融后7天(CIK細(xì)胞治療前)、消融后14天(CIK細(xì)胞治療后)三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，P

11、BMC在CEA抗原肽刺激下分泌IFN-γ的能力。
　　結(jié)果:RFA+CIK組和RFA組中位PFS分別是23個(gè)月、18個(gè)月，2年P(guān)FS率分別為41.9％和26.7％，3年P(guān)FS率分別為20.3％和13.3％，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0336)。RFA組的中位OS為43個(gè)月，RFA+CIK組目前還在隨訪(fǎng)中。RFA組3年OS率為64.6％，而RFA+CIK組3年OS率為81％，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.1187)。ELISPOT試

12、驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RFA+CIK組，8名外周血CEA＞50ng/ml的患者中，消融后7天(CIK細(xì)胞治療前)有6名患者PBMC中具有分泌IFN-γ能力的細(xì)胞數(shù)量較消融前增加(P=0.010);而在消融后14天（CIK細(xì)胞治療后），有7名患者PBMC中具有分泌IFN-γ能力的細(xì)胞數(shù)量較消融后7天(CIK細(xì)胞治療前)增加(P=0.028)。這8名患者在消融聯(lián)合CIK細(xì)胞治療后PBMC中具有分泌IFN-γ能力的細(xì)胞數(shù)量均較治療前增加(P=0.001)，差

13、異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:RFA聯(lián)合CIK細(xì)胞治療可增強(qiáng)結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者腫瘤抗原特異性免疫應(yīng)答，延長(zhǎng)疾病進(jìn)展時(shí)間(PFS)，具有協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)。
　　綜上所述，本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)兩部分探討RFA聯(lián)合CIK細(xì)胞的協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)建立雙側(cè)背部荷瘤小鼠模型，利用荷瘤鼠脾臟細(xì)胞制備CIK細(xì)胞，臨床研究入組結(jié)直腸癌術(shù)后單純肝轉(zhuǎn)移患者。本研究明確了:1）RFA聯(lián)合CIK細(xì)胞治療可增強(qiáng)消融區(qū)外腫瘤微環(huán)境中抗腫瘤免疫反