腫瘤全細(xì)胞抗原負(fù)載的DC與CIK共培養(yǎng)對(duì)腎癌細(xì)胞殺傷活性的研究.pdf

1、目的： 采用CCK-8檢測(cè)自體/異體抗原負(fù)載的DC與CIK共培養(yǎng)以及無(wú)抗原負(fù)載的DC與CIK共培養(yǎng)、單獨(dú)培養(yǎng)CIK對(duì)自體原代培養(yǎng)腎癌細(xì)胞的殺傷活性，探討腎癌免疫治療體外不同免疫細(xì)胞殺瘤活性差異，為臨床上腫瘤抗原不明確的腎癌免疫治療提供一種新的研究思路。 方法： 一、腎癌細(xì)胞培養(yǎng)及腫瘤胞抗原制備 采用組織塊貼壁法、機(jī)械分散法及差速貼壁分離法，混合酶消化法及差速貼壁分離法分離腎癌細(xì)胞，比較這幾種方法培養(yǎng)腎癌細(xì)

2、胞的優(yōu)劣并優(yōu)化，體外培養(yǎng)出實(shí)驗(yàn)所需短期原代腎癌細(xì)胞。超聲破碎法獲取原代培養(yǎng)腎癌細(xì)胞自體腫瘤細(xì)胞全抗原，反復(fù)凍融法獲取異體腎癌細(xì)胞系769-P腫瘤細(xì)胞全抗原。 二、DC、CIK的體外誘導(dǎo)擴(kuò)增、抗原負(fù)載及表型檢測(cè) 分離自體及健康供外周血單個(gè)核細(xì)胞體外誘導(dǎo)制備DC、CIK細(xì)胞。于第8d天收集DC、CIK細(xì)胞，進(jìn)行共培養(yǎng)，分為無(wú)抗原DC組，自體腫瘤全細(xì)胞抗原遞呈DC組，異體腫瘤細(xì)胞裂解物抗原遞呈DC組，以10:1的比例與培養(yǎng)至第

3、8d的CIK混合培養(yǎng)，三天后進(jìn)行靶細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC表面成熟標(biāo)志CD83、CD80、CD86、HLA-DR的表達(dá)，CIK細(xì)胞檢測(cè)CD3、CD4、CD8、CD56的表達(dá)。 三、DC-CIK誘導(dǎo)的特異性殺傷作用檢測(cè) 應(yīng)用CCK-8法檢測(cè)CIK，CIK-DC，CIK-DC-自體A，CIK-DC-異體A分別對(duì)腎癌細(xì)胞系769-P及原代培養(yǎng)腎癌細(xì)胞的殺瘤活性。 結(jié)果： 一、腎癌細(xì)胞培養(yǎng) 三種培

4、養(yǎng)方法比較，組織塊貼壁法分離的細(xì)胞損傷最小，且細(xì)胞狀態(tài)好，但細(xì)胞種類多，純化困難，生長(zhǎng)時(shí)間長(zhǎng)；機(jī)械分離法細(xì)胞損傷最重，細(xì)胞種類多，但生長(zhǎng)時(shí)間比組織塊貼壁法短；混合酶消化法所得的細(xì)胞損傷程度次之，分步貼壁后可獲得較純的腫瘤細(xì)胞，培養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)間最短，后續(xù)時(shí)間均采用此法提取培養(yǎng)腎癌細(xì)胞。所有實(shí)驗(yàn)均采用生長(zhǎng)狀態(tài)最佳的第三代細(xì)胞；100mg腎癌組織經(jīng)超聲破碎后可獲取30～50mg全細(xì)胞抗原；1瓶長(zhǎng)滿的腎癌細(xì)胞(1～3×107)提取出的全抗原約為30

5、～60mg。 二、DC、CIK的體外培養(yǎng)及抗原檢測(cè) 外周血單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)GM-CSF、IL-4誘導(dǎo)可獲得5％～10％的成熟DC。加入腫瘤裂解物抗原及誘導(dǎo)成熟因子后，DC表面成熟標(biāo)志CD83、CD80、CD86、HLA-DR的表達(dá)明顯增加。與DC共培養(yǎng)CIK表面抗原CD3+、CD3+ CD4+、CD3+CD56+、CD3+CD8+均比單獨(dú)培養(yǎng)CIK高。 三、DC-CIK誘導(dǎo)的特異性殺傷作用 結(jié)果：顯示，自體

6、全抗原刺激的CIK-DC-自體A組與與異體全抗原刺激的CIK-DC-異體A組殺瘤活性最大，兩者之間無(wú)差異，未經(jīng)抗原刺激的CIK-DC組次之，單純CIK組殺瘤活性最低；四組效應(yīng)細(xì)胞組間殺傷率相關(guān)性分析顯示，除CIK-DC-自體A組與CIK-DC-異體A組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，各組間差異均顯著，各組之間殺傷率比較具有正相關(guān)關(guān)系；健康組與患者組效應(yīng)細(xì)胞殺傷活性比較，腎癌患者外周血?dú)⒘龌钚员冉】倒┱邭⒘龌钚缘停薪y(tǒng)計(jì)學(xué)意義；原代培養(yǎng)腎癌細(xì)胞患

7、者自體效應(yīng)細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)組與原代培養(yǎng)腎癌細(xì)胞患者異體健康效應(yīng)細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)組比較，腎癌細(xì)胞患者自體效應(yīng)細(xì)胞與異體健康效應(yīng)細(xì)胞差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；此外，各實(shí)驗(yàn)組間兩兩比較，差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論： 1、自體全抗原或異體全抗原刺激的DC以及無(wú)處理因素刺激的DC與CIK共培養(yǎng)后，CIK細(xì)胞在免疫表型，增殖及殺瘤能力都有明顯提高； 2、DC細(xì)胞經(jīng)自體全抗原或異體全抗原刺激后，免疫表型及增值能力均提高，與