嚴重急性呼吸綜合征（SARS）實驗室診斷技術(shù)的基礎與應用研究.pdf

1、嚴重急性呼吸綜合征(SARS)是21世紀對人類造成極大威脅的一種新發(fā)急性病毒性傳染病，致病原為一種新的冠狀病毒，命名為SARS冠狀病毒。由于SARS沒有特效的治療藥物，其臨床癥狀沒有特異性，很難與其它急性呼吸道病毒性疾病區(qū)分開，而早期診斷，及時隔離，切斷傳播源是當時控制SARS疫情唯一可行的途徑。因此，靈敏、特異的早期診斷技術(shù)，對早期發(fā)現(xiàn)傳染源，及時阻斷SARS的傳播途徑至關(guān)重要。然而，RT-PCR等檢測技術(shù)不穩(wěn)定，影響因素多，易出現(xiàn)假

2、陽性，還需要昂貴儀器及熟練技術(shù)人員，不利于推廣，血清學方法不能在SARS發(fā)病的早期提供診斷結(jié)果。本課題旨在研究一種準確、特異、靈敏及簡便的SARS實驗室早期檢測技術(shù)，并探討其在臨床應用中的價值。 本研究通過分析SARS-CoV所編碼的蛋白質(zhì)及其基因與已知冠狀病毒的相關(guān)性，選擇SARS-CoV核衣殼蛋白為研究的靶抗原。由于冠狀病毒N蛋白是一種高度保守的主要結(jié)構(gòu)蛋白，也是病毒主要的抗原蛋白，作為免疫診斷試劑的候選抗原可能要比其它冠狀

3、病毒的結(jié)構(gòu)蛋白更具有研究意義。通過對N蛋白基因的克隆、蛋白表達及其抗原性的鑒定，研究SARS患者針對N蛋白特異性抗體產(chǎn)生的規(guī)律和SARS-CoVN蛋白與其它冠狀病毒抗原的相關(guān)性，應用改良快速的雜交瘤單克隆抗體技術(shù)，制備一組特異性抗N蛋白單克隆抗體，進一步對這組單抗的免疫學特性、識別抗原位點及特異性進行研究，利用單克隆抗體識別抗原表位的專一性和雙抗體夾心捕獲抗原的原理，用不同來源的SARS-CoV抗原反復篩選抗體及對抗體的優(yōu)化組合，建立抗

4、體夾心捕獲病毒抗原的方法，以期研發(fā)出特異、靈敏的SARS-CoV抗原快速測定試劑盒。 目的： (1)研究SARS患者血清中SARS-CoV核衣殼蛋白抗原和抗體之間的消長規(guī)律，探討N蛋白在SARS早期診斷中的作用； (2)建立一種SARS-CoVN抗原快速測定方法，直接檢測SARS患者早期血中的SARS-CoVN蛋白抗原，實現(xiàn)對SARS的早期診斷； (3)研究SARS-CoVN蛋白與其它冠狀病毒的抗原相關(guān)性

5、，探討N蛋白在冠狀病毒感染的診斷及鑒別診斷、流行病學和SARS溯源研究中作用。 本研究的發(fā)現(xiàn)和創(chuàng)新點如下： 一、本研究率先闡明SARS患者血清SARS-CoV核衣殼蛋白抗原和抗體之間的消長規(guī)律，首次證實了SARS-CoV核衣殼蛋白為SARS早期診斷的重要標志物，并率先提出檢測血中N蛋白可作為SARS實驗室診斷的重要指標。 二、率先建立以SARS-CoVN蛋白為靶抗原的抗原捕獲方法，可直接從SARS患者發(fā)病早期血中

6、檢出病毒N蛋白抗原，臨床研究證明該方法在SARS患者發(fā)病的第一天血中檢出SARS-CoVN蛋白抗原，對發(fā)病5天內(nèi)N蛋白檢測的陽性率達90％以上，特異度達99％，其靈敏度和特異性均高于PCR測定方法。 三、建立兩個SARS-CoVN蛋白測定試劑盒(酶聯(lián)免疫法和增強化學發(fā)光免疫分析法)，均首個獲得了國家食品藥品監(jiān)督管理局批準，并正式頒發(fā)新藥證書及生產(chǎn)批準文號，可作為發(fā)熱門診患者的常規(guī)檢測、急性呼吸道疾病的鑒別診斷以及排查SARS患者