新基因Ercc61在P19胚胎癌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)研究.pdf

1、研究目的：探討基因Ercc61在P19胚胎癌細(xì)胞及P19分化細(xì)胞中的表達(dá)情況，并構(gòu)建Ercc61的正、反義真核表達(dá)載體，在細(xì)胞學(xué)水平對(duì)基因功能進(jìn)行初步研究。 研究方法：用一定濃度的二甲亞砜(DMSO)和維甲酸(RA)分別誘導(dǎo)處理P19胚胎癌細(xì)胞，使其分別向心肌細(xì)胞方向和神經(jīng)細(xì)胞方向分化，提取P19細(xì)胞總RNA，RT-PCR檢測(cè)P19細(xì)胞誘導(dǎo)分化前后Ercc61 mRNA的表達(dá)變化。用限制性?xún)?nèi)切酶Xho Ⅰ和Kpn Ⅰ雙酶切含目的

2、基因的pGEM-T-Ercc61載體，獲得目的基因Ercc61序列，將其插入到真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1(-)Myc His6多克隆位點(diǎn)的Xho Ⅰ和Kpn Ⅰ的酶切位點(diǎn)，相連構(gòu)成基因表達(dá)質(zhì)粒。將重組后的質(zhì)粒進(jìn)行細(xì)菌轉(zhuǎn)化，先菌落PCR鑒定，然后質(zhì)粒擴(kuò)增、純化后，再限制性?xún)?nèi)切酶Xho Ⅰ和Kpn Ⅰ酶切鑒定。以脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染正義載體至P19細(xì)胞，RT-PCR檢測(cè)基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)活性情況，并用MTT

3、法測(cè)定轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖活性變化。聯(lián)合化療藥物順鉑處理P19細(xì)胞，MTT比色法檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，同時(shí)分析用順鉑處理P19細(xì)胞后，Ercc61mRNA的表達(dá)變化。 研究結(jié)果：RT-PCR檢測(cè)表明，基因Ercc61在P19胚胎癌細(xì)胞中不表達(dá)，DMSO和RA分別誘導(dǎo)處理P19細(xì)胞后，在誘導(dǎo)期及向心肌細(xì)胞方向和神經(jīng)細(xì)胞方向分化的細(xì)胞中均檢測(cè)到Ercc61 mRNA表達(dá)活性；化療藥物順鉑處理P19細(xì)胞未觀察到Ercc61基因表達(dá)的變化